Bcl-2家族在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及Bcl-XL siRNA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、大量研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞增殖與凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡受到破壞有關(guān)。Bcl-2家族蛋白是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，它們中有些能抑制細(xì)胞凋亡(如Bcl-2、Bcl-XL)，而另外一些則會(huì)促進(jìn)凋亡(如Bax、Bak)，因此它們表達(dá)的改變將直接影響著腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性。結(jié)直腸癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最近流行病學(xué)資料顯示其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢(shì)，因此檢測(cè)Bcl-2家族在結(jié)直腸癌中的表達(dá)并研究其作用將為結(jié)直腸癌的化學(xué)治療和基因治療提供新

2、的依據(jù)。 本課題采用RT-PCR法對(duì)40例新鮮結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本中的癌組織及癌旁組織的Bcl-2、Bcl-XL和Bax進(jìn)行了mRNA水平檢測(cè)，結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，癌組織與癌旁組織間表達(dá)的比較用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，與臨床病理相關(guān)因素的關(guān)系，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的Bcl-2mRNA表達(dá)水平均較低，大部分標(biāo)本檢測(cè)不到或只有很弱的條帶，兩者之間表達(dá)無(wú)顯著差異；所有

3、標(biāo)本均能檢測(cè)到Bcl-XLmRNA表達(dá)，且癌組織明顯高于癌旁組織(P=0.01)；BaxmRNA表達(dá)水平較Bcl-2、Bcl-XL高，但癌組織和癌旁組織間表達(dá)無(wú)顯著差異。癌組織和癌旁組織問(wèn)Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bax的比值亦無(wú)顯著差異，而且三個(gè)基因在癌組織的mRNA水平均與臨床病理相關(guān)因素(性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期)無(wú)關(guān)。同時(shí)為了解它們的蛋白水平，本課題采用免疫組化MaxVision二步法檢

4、測(cè)了上述40例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織及33例存檔結(jié)直腸癌蠟塊中Bcl-2、Bcl-XL和Bax蛋白的表達(dá)情況，后者己獲隨訪資料，免疫組化結(jié)果用等級(jí)評(píng)分法評(píng)定，結(jié)果癌組織與癌旁組織間表達(dá)的比較用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，與臨床病理相關(guān)因素的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，生存分析用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，生存曲線用Kaplan-Meier檢驗(yàn)。結(jié)果如下：73例結(jié)直腸癌組織和40例癌旁組織中，Bcl-2蛋白表達(dá)較弱，總陽(yáng)性率分別為50.7％(37/73)

5、、47.5％(19/40)；Bcl-XL蛋白表達(dá)較強(qiáng)，總陽(yáng)性率分別為82.2％(60/73)、70.0％(28/40)；Bax蛋白表達(dá)最強(qiáng)，總陽(yáng)性率分別為87.3％(64/73)、80％(32/40)。只有Bcl-XL蛋白的表達(dá)癌組織明顯高于癌旁組織，兩者之間的差異具有顯著性意義(P=0.002)，Bcl-2蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期成負(fù)相關(guān)(P=0.037、0.022)，并且是影響總生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素(P=0

6、.011、0.033，RR=2.11、1.935，95％CI1.184-3.762、1.056-3.544)，Bcl-2蛋白表達(dá)陰性者生存率低于陽(yáng)性表達(dá)者(P=0.0226)，其他都與臨床病理相關(guān)因素和預(yù)后無(wú)關(guān)。基于上述結(jié)果，為探討特異性下調(diào)Bcl-XL誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞系凋亡的作用，本課題最后采用人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1，利用人工合成的Bcl-XL靶向的小分子干擾RNA(siRNA)下調(diào)Bcl-XL蛋白，通過(guò)Westernblot法檢測(cè)處

7、理后Bcl-XL蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后細(xì)胞的凋亡情況，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)存活細(xì)胞，結(jié)果采用t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Bcl-XLsiRNA組的Bcl-XL蛋白表達(dá)顯著性下降，凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05)。 從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出以下主要結(jié)論：(1)在結(jié)直腸癌中，Bcl-XL的蛋白和mRNA表達(dá)均明顯強(qiáng)于Bcl-2，說(shuō)明Bcl-XL可能起著更為重要的作用，同時(shí)可能是潛