Bcl-2家族成員在萊菔硫烷誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　 涎腺腺樣囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一。好發(fā)于腭部的小唾液腺及腮腺，其次為下頜下腺。該腫瘤具有轉(zhuǎn)移性極強(qiáng)、易沿神經(jīng)擴(kuò)散和血行性轉(zhuǎn)移率高等重要特征，其發(fā)病率在口腔頜面部惡性腫瘤中居第二位。目前對(duì)于涎腺腺樣囊性癌的臨床治療手段以手術(shù)切除為主，但手術(shù)切除后也常會(huì)發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率在口腔頜面部居首位。然而，涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病及

2、轉(zhuǎn)移機(jī)制目前仍不完全清楚。因此探索新的預(yù)防和治療方法，提高對(duì)涎腺腺樣囊性癌的療效，改善患者的生存質(zhì)量是很有必要的。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)增加十字花科蔬菜的攝入能夠減少癌癥的發(fā)生，其抗腫瘤作用的主要成分是一系列異硫氰酸酯，其中萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)因其抗腫瘤效果最佳而受到廣泛關(guān)注。隨著對(duì)萊菔硫烷抗腫瘤作用研究的不斷進(jìn)展，目前對(duì)其抗癌機(jī)制的研究已從細(xì)胞水平上升至分子水平。如在DU-145細(xì)胞（前列腺癌）中，SFN引起細(xì)胞

3、凋亡伴有裂解的Caspase-3增加和Bcl-2表達(dá)的減少。在胰腺癌細(xì)胞中也可引起Caspase-3的裂解。SFN可通過激活多種分子機(jī)制，來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SFN能夠抑制腺樣囊性癌細(xì)胞ACC-M的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。并且Caspase在SFN誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌ACC-M凋亡過程中起重要作用。但是在SFN誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞凋亡的過程中，Bcl-2家族成員是否起重要作用，國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究擬對(duì)體外

4、培養(yǎng)的人腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M經(jīng)過SFN處理后，采用WesternBlot方法，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl以及促凋亡蛋白Bax，Bak的含量，驗(yàn)證在SFN誘導(dǎo)ACC-M凋亡過程中Bcl-2家族成員的表達(dá)及意義，從而為在腺樣囊性癌的多模式治療中拓展新的植物化學(xué)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、材料
　　 1.1、ACC-M:由上海交通大學(xué)口腔頜面外科實(shí)驗(yàn)室提供，細(xì)胞系建立于199

5、5年;
　　 1.2、萊菔硫烷(SFN):由匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心頭頸外科提供，購自LKT實(shí)驗(yàn)室，純度≥99％。
　　 2、方法
　　 2.1、藥液配制:萊菔硫烷(SFN)用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成100mmol/L的儲(chǔ)存液，存于-20℃冰箱中，使用前用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋。
　　 2.2、細(xì)胞培養(yǎng):將凍存的細(xì)胞系予以復(fù)蘇，培養(yǎng)液采用RPMI1640加入10％的胎牛血清和鏈霉素（100μg/mL

6、）、青霉素（100U/mL），將復(fù)蘇后的細(xì)胞置于37℃、5％CO2恒溫恒濕箱培養(yǎng)，隔天換液，約72-96小時(shí)可以傳代。
　　 2.3、細(xì)胞接種及藥物處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)消化液(0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA(1∶1)混合液）消化后制成4.0×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，根據(jù)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別接種于對(duì)照組、4小時(shí)組、8小時(shí)組、16小時(shí)組、24小時(shí)組五個(gè)培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種2ml的細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱。待細(xì)胞貼壁（接種后2

7、4小時(shí)）后進(jìn)行藥物處理。將100mmol/L的萊菔硫烷(SFN)儲(chǔ)存液稀釋成濃度為40μmol/L的溶液，將貼壁后的細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，棄掉培養(yǎng)液，于4，8，16，24各組中分別加入濃度為40μmol/L的萊菔硫烷溶液3ml，于對(duì)照組加入含相同濃度二甲基亞砜的RPMI1640培養(yǎng)液3ml作為對(duì)照。待藥物作用4、8、16、24小時(shí)后進(jìn)行各組細(xì)胞組織蛋白的提取。
　　 2.4、細(xì)胞組織蛋白的提取:將對(duì)照組和經(jīng)藥物處理的細(xì)胞用PBS平衡

8、鹽溶液洗滌兩遍，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，各自移入相應(yīng)EP管中。4℃下，3000rmp，離心15min。吸走上清液，留沉淀，經(jīng)再次PBS洗滌吹打后，800rmp，離心5min，棄上清。于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中各加入細(xì)胞裂解液400μl，放于冰上裂解20-30min（震蕩均勻后裂解）。將裂解后的細(xì)胞于4℃下，13000rmp，離心15min，離心完畢取上清液即為所提取的細(xì)胞蛋白，將蛋白分裝至相應(yīng)EP管-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.5、

9、蛋白的定量:利用分光光度儀法測(cè)定蛋白濃度。分光光度法是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，從而對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。本實(shí)驗(yàn)在波長(zhǎng)為595nm下測(cè)定各樣本吸光度值。根據(jù)公式:蛋白含量=測(cè)定蛋白吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度值×標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(0.563g/1)×10得出測(cè)定樣品蛋白濃度。
　　 2.6、采用westernblot免疫印跡技術(shù)檢測(cè)促凋亡蛋白Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá):經(jīng)SDS--P

10、AGE(電泳);轉(zhuǎn)膜;封閉;孵育一抗二抗;洗滌;暗室顯影定影等過程獲得蛋白條帶膠片，之后利用電泳凝膠成像分析軟件，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行量化分析，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三遍，匯總所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。
　　 結(jié)果:
　　 結(jié)果顯示:經(jīng)40μmol/LSFN處理后，人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)有隨著藥物作用時(shí)

11、間延長(zhǎng)呈逐漸增加趨勢(shì)，Bak蛋白的表達(dá)量也隨著時(shí)間延長(zhǎng)有所增加，但不如Bax蛋白明顯;而Bcl-2蛋白和Bcl-xl蛋白的表達(dá)則隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)有逐漸減少趨勢(shì)。Bax:Bcl-2比率增加。ACC-M細(xì)胞系經(jīng)40μmol/LSFN作用24小時(shí)，其Bax蛋白的表達(dá)量是對(duì)照組的1.63倍(P＜0.001)，Bak蛋白較對(duì)照組增加了的44％(P＜0.001)，而Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表達(dá)量分別減少至對(duì)照組的43％和41％(P＜0.001