p62-SQSTM1與自噬在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　近年來，自噬在腫瘤中發(fā)生中的作用越來越受到關(guān)注。結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制已有較多的研究，但機(jī)制仍不十分明了。p62蛋白是一個參與自噬、凋亡和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵蛋白，深入研究p62蛋白以及自噬與結(jié)腸癌的關(guān)系，對闡明結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療策略具有積極的意義。
　　研究方法:
　　收集119例散發(fā)的結(jié)腸癌患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤大小、病理類型及分化程度、臨床病理

2、分期等，并收集新鮮手術(shù)標(biāo)本。通過免疫組化、實時定量PCR和免疫印跡方法檢測p62蛋白在腫瘤組織和癌旁正常對照組織中的表達(dá)，同時用免疫熒光和免疫印跡方法檢測自噬標(biāo)記蛋白LC3的表達(dá)，結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　同時根據(jù)人P62基因的mRNA序列構(gòu)建shRNA病毒干擾質(zhì)粒，利用293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生病毒顆粒。感染HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞系，通過實時定量PCR和免疫印跡技術(shù)檢測病毒干擾的效果。將p62干擾成功的HCT-116細(xì)

3、胞系進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移能力的檢測。同時，將干擾成功的HCT-116細(xì)胞系，進(jìn)行裸鼠成瘤實驗，觀察干擾p62蛋白的HCT-116細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的改變。體外細(xì)胞干擾p62蛋白表達(dá)后，觀察其對細(xì)胞自噬的影響，以及對自噬激抑制劑(3-MA)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用的影響。
　　研究結(jié)果:
　　我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p62蛋白和mRNA在癌旁正常組織和結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)。通過對119例結(jié)腸癌患者的臨床資料顯示，結(jié)腸癌組

4、織p62mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量顯著高于癌旁正常對照組。同時，LC3蛋白在結(jié)腸癌組織中點狀聚集程度顯著高于癌旁正常對照組。同時western blot結(jié)果也顯示，LC3-Ⅱ的表達(dá)量在結(jié)腸癌組織中顯著高于癌旁正常組織。這些結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中的自噬水平高于癌旁正常組織。結(jié)腸癌組織中p62和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型分化程度、臨床病理分期無顯著相關(guān)性，提示p62和自噬可能只是在結(jié)腸癌的發(fā)生階段

5、發(fā)揮一定的作用。
　　為了深入探討p62和自噬在腫瘤發(fā)展過程中可能的作用，我們通過shRNA病毒干擾質(zhì)粒，在體外包裝、純化后，成功獲得高滴度慢病毒載體顆粒;通過慢病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞系，能顯著地抑制p62mRNA水平及p62蛋白的表達(dá)。干擾p62后，HCT116細(xì)胞的細(xì)胞生長、增殖以及克隆形成明顯受抑制，體內(nèi)裸鼠成瘤實驗也證實，HCT-116細(xì)胞的成瘤能力減弱。我們也發(fā)現(xiàn)，干擾p62后，HCT-116細(xì)胞的自噬受到