2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  乳腺癌被公認(rèn)為是女性癌癥死亡的首要原因。盡管早期診斷和有效治療極大的降低了致死率,但是仍有很大一部分患者在治療過程中出現(xiàn)了明顯的耐藥和復(fù)發(fā)現(xiàn)象。近年來,伴隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說研究的興起,越來越多的研究證據(jù)表明,乳腺癌腫瘤干細(xì)胞是乳腺癌中極少數(shù)的一部分具有自我更新及多向分化潛能的特殊群體,這一群體驅(qū)動(dòng)腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗并與治療后期出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)息息相關(guān)。所以,尋找針對(duì)腫瘤干細(xì)胞治療的特異性靶點(diǎn),將為惡性腫瘤的治療開辟

2、一條新的途徑。
  信號(hào)樞紐蛋白p62作為一種多結(jié)構(gòu)域多功能蛋白,主要通過與Raptor,TRAF6,RIP1和Keap1等多種信號(hào)分子相互作用,廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)控(例如mTOR,NF-κB和NRF2)。眾多的研究結(jié)果表明,多種常見惡性實(shí)體瘤(包括乳腺癌)中都存在p62蛋白的異常過表達(dá),但p62如何調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,以及p62蛋白的表達(dá)與乳腺癌腫瘤干細(xì)胞干性的關(guān)系,尚無系統(tǒng)合理的論證,需要我們?nèi)ミM(jìn)一步深入探索和研

3、究。
  方法:
  (1)①通過ALDH1+細(xì)胞群流式分選,獲得乳腺癌腫瘤干細(xì)胞群體,通過Western blot和RT-qPCR實(shí)驗(yàn),比較ALDH1+與ALDH1-群體中p62(SQSTM1)基因和蛋白的表達(dá)情況;②通過微球懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),獲得乳腺癌干細(xì)胞群體,比較“干性”微球與普通貼壁細(xì)胞兩組之間p62的差異表達(dá)情況。
  (2)①通過ALDH1陽性分析,比較敲降或高表達(dá)p62的情況下,乳腺癌細(xì)胞中ALDH1陽性比

4、例的變化;②通過體外微球懸浮培養(yǎng),比較干預(yù)p62表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞微球形成能力(直徑、數(shù)目)的影響。
  (3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):①通過ALDH1+流式分選的方法,分別從對(duì)照組(shNC)和敲降p62(shp62)的MDA-MB-231細(xì)胞中分離出具有“干性”的細(xì)胞,并通過RT-qPCR驗(yàn)證兩組干性相關(guān)基因表達(dá)情況;②分別從兩組ALDH1+群體中取等量的5×104細(xì)胞接種于NOD/SCID雌鼠皮下(每組6只),培養(yǎng)6周后比較兩組的成瘤率和腫

5、瘤體積。
  (4)①通過基因表達(dá)譜芯片(AFFYMETRIX Human Primeview)對(duì)移植瘤組織進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序(每組進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)測(cè)序);②將表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果(>1.5倍)與干細(xì)胞基因集進(jìn)行比較分析差異表達(dá)基因;③從基因和蛋白水平分別對(duì)移植瘤組織中伴隨p62變化的下游靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證;④通過對(duì)表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因集富集分析(GSEA),進(jìn)一步驗(yàn)證p62與下游靶標(biāo)分子之間的關(guān)系。
  (5)①在乳腺癌細(xì)胞系中對(duì)p62

6、基因進(jìn)行瞬時(shí)敲降(干擾序列si#1、si#2)以及外源性瞬時(shí)過表達(dá),從基因和蛋白水平檢測(cè)上述所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因的變化;②引入耐受表柔比星的MCF-7(EpiR-MCF-7)細(xì)胞系作為高表達(dá)干性特征的細(xì)胞模型,通過體外微球懸浮培養(yǎng),將高表達(dá)靶標(biāo)基因的EpiR-MCF-7-shp62組與EpiR-MCF-7-shp62組的微球形成大小和數(shù)目進(jìn)行比較。
  (6)①構(gòu)建該差異表達(dá)基因的報(bào)告基因載體,通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),檢測(cè)p6

7、2蛋白對(duì)該差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子活性有無影響;②將細(xì)胞系用放線菌素D處理,處理時(shí)間分別為0、30、60和90分鐘,收集樣品檢測(cè)p62蛋白對(duì)該重要基因mRNA半衰期的影響;③通過RNA-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p62蛋白是否可與該差異表達(dá)基因的mRNA直接結(jié)合;④若p62蛋白與該差異表達(dá)基因之間沒有結(jié)合,則進(jìn)一步探索可調(diào)控該差異表達(dá)基因mRNA穩(wěn)定性的中間分子(例如microRNA家族),通過RT-qPCR和Western blot方法進(jìn)行驗(yàn)證。

8、>  結(jié)果:
  (1)p62在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)情況:①RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,相較于ALDH1-組,ALDH1+細(xì)胞中p62的表達(dá)量更高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);②RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,微球中p62基因和蛋白的表達(dá)量顯著高于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
  (2)體外細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果:①ALDH1+流式分析結(jié)果顯示,ALDH1

9、+群體所占比例隨p62表達(dá)量的下降而下降,隨p62表達(dá)量的升高而升高;②體外微球懸浮培養(yǎng)結(jié)果顯示,敲降p62可顯著降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞一代、二代微球形成能力(微球直徑變小、數(shù)目減少);高表達(dá)p62可增加MCF-7細(xì)胞一代、二代微球形成能力。
  (3)體內(nèi)功能學(xué)研究結(jié)果:①RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,通過ALDH1+流式分選方法獲得的“干性”群體中,shp62組中p62,NANOG,SOX2和POU5F1的mRNA表

10、達(dá)水平明顯低于shNC組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);②MDA-MB-231對(duì)照組成瘤率為100%(6/6);敲降p62組,成瘤率為83.3%(5/6);且相較于對(duì)照組,p62敲降組的腫瘤體積明顯減小,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
  (4)①②根據(jù)表達(dá)譜芯片測(cè)序結(jié)果(>1.5倍)與干細(xì)胞基因集進(jìn)行比對(duì),我們共得到28個(gè)差異表達(dá)基因(NLE1,SRSF3, POLD2, TDP2, HSPA9, CHEK1,NUD

11、T1,F(xiàn)C5, ITGB3BP, MCM6, ARL4A, LUC7L3, CUL4A, MCM3, SET, NOG, SP1, HMGB1,MRE11A,POLR1C,RFC3,NCRIP,MCM4,GMNN,MYC,BX1);③通過RT-qPCR和Western blot進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示:shp62組中MYC基因的表達(dá)水平顯著低于shNC組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);④GSEA結(jié)果顯示,shp62組MYC下游靶基因表達(dá)

12、水平顯著低于shNC組。
  (5)①在乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、BT-549、SKBR-3)對(duì)p62基因進(jìn)行瞬時(shí)敲降,可下調(diào)MYC基因mRNA水平及c-Myc蛋白水平;瞬時(shí)高表達(dá)p62(MDA-MB-231、MCF-7)可上調(diào)MYC基因mRNA水平及c-Myc蛋白水平;②微球懸浮培養(yǎng)結(jié)果表明,在EpiR-MCF-7-shp62細(xì)胞中重建MYC高表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)因敲降p62所造成的微球形成數(shù)目少、體積小的情況。
  (

13、6)①Luciferase實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p62的高表達(dá)沒能引起熒光素酶活性的明顯變化(P>0.05)(MDA-MB-231、MCF-7);②放線菌素D抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞中MYC基因mRNA的半衰期為38.68分鐘;高表達(dá)p62可使MYC基因mRNA的半衰期延長(zhǎng)至70.88分鐘;③對(duì)RNA-IP所得樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,p62與同型對(duì)照(IgG)組均未檢測(cè)到MYC基因mRNA的存在;④RT-qP

14、CR結(jié)果顯示,高表達(dá)p62后,let-7家族中l(wèi)et-7a和let-7b的表達(dá)水平受到抑制;在p62高表達(dá)組中加入let-7a/b的模擬物,可觀察到對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中MYC基因和蛋白的表達(dá)水平均顯著下降。
  結(jié)論:
  (1)在乳腺癌干細(xì)胞干性群體中,p62基因和蛋白表達(dá)水平均明顯升高;
  (2)p62對(duì)乳腺癌干細(xì)胞干性的維護(hù)起到重要的作用;
  (3)干預(yù)p62表達(dá)可引起MYC基因mRNA水平的變化;MYC在

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