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文檔簡介
1、目的:
乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的主要惡性腫瘤之一,同時(shí)也是世界女性發(fā)病率最高的癌癥。全世界每年約有120萬女性患乳腺癌,50萬死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達(dá)國家,乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位。而我國是乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一,我國近年來乳癌發(fā)病率正以每年3%的速度遞增,成為城市中死亡率增長最快的癌癥,發(fā)病年齡也呈逐漸年輕化的趨勢。在上海等大中城市中,乳腺癌患病率已連續(xù)20年位居女性惡性腫瘤第一位,嚴(yán)重危害廣大女性的健
2、康。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類進(jìn)化上保守的非編碼小分子RNA,具有在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)的功能。這些miRNAs可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長,組織分化,因而與生命過程中發(fā)育、疾病有關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn),miRNA的表達(dá)與多種腫瘤相關(guān),在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用,這些miRNAs的作用類似于抑癌基因和癌基因。不同腫瘤中miRNA有不同的表達(dá)譜。一種miRNA可以靶向多種靶基因從而發(fā)揮作用,而一個(gè)靶基因可以同時(shí)被多種miRNA
3、靶向。最新研究表明,Smad7在乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本研究中,我們通過targetscan,miRanda等軟件分析發(fā)現(xiàn)Smad7可能為miR-497的靶基因,運(yùn)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和Western Blot研究方法證實(shí)miR-497通過靶向Smad7來發(fā)揮作用,同時(shí)在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系中驗(yàn)證高表達(dá)miR-497對細(xì)胞功能的影響,為乳腺癌的個(gè)體化治療提供新的靶點(diǎn)。
方法:
4、我們根據(jù)websites targetscan,miRanda,miRGen and miRBase等軟件發(fā)現(xiàn),Smad7為miR-497可能的靶基因。為了驗(yàn)證miR-497是否可以靶向Smad7的3'-UTR區(qū)從而發(fā)揮生物學(xué)作用,我們設(shè)計(jì)了雙熒光素酶實(shí)驗(yàn),同時(shí)運(yùn)用RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)來證實(shí)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。MTT實(shí)驗(yàn),平板克隆實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)來研究miR-497在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7
5、乳腺癌細(xì)胞系中的作用。
結(jié)果:
1、本研究中,運(yùn)用websites targetscan,miRanda,miRGen and miRBase等軟件發(fā)現(xiàn),miR-497的堿基序列與Smad7 mRNA3'-UTR區(qū)存在互補(bǔ)關(guān)系,Smad7為miR-497的靶點(diǎn)之一。
2、通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中,實(shí)驗(yàn)組(共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Smad73'-UTR)與對照組
6、(共轉(zhuǎn)染miR-497 control與Smad73'-UTR)相比,熒光值明顯下降(P<0.05)。共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Smad73'-UTR-mut后,熒光值上升(P<0.05)。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中,實(shí)驗(yàn)組(共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Smad73'-UTR)與對照組(共轉(zhuǎn)染miR-497 control與Smad73'-UTR)相比,熒光值明顯下降(P<0.05)。共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics
7、與Smad73'-UTR-mut后,熒光值上升(P<0.05)。
3、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中,分別過表達(dá)miR-497后,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和Western Blot實(shí)驗(yàn)分別檢測Smad7 mRNA表達(dá)量與Smad7蛋白的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在miR-497過表達(dá)組Smad7 mRNA與Smad7蛋白的表達(dá)量均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
4、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)
8、胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中,分別按照0、25、50、75、100nmol/l濃度轉(zhuǎn)染miR-497,培養(yǎng)24h、48h、72h后,加入MTT在490nm下測得相應(yīng)OD值繪制曲線后分析,隨著時(shí)間和濃度的增加,抑制率隨之增加,表現(xiàn)出時(shí)間和濃度的依賴性,表明,miR-497有抑制細(xì)胞增殖的作用。
5、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中,分別轉(zhuǎn)染miR-497 mimics(100nM)與miR-497
9、control,培養(yǎng)48h后,平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,與miR-497 control組相比,miR-497 mimics組克隆形成率明顯下降,表明,miR-497有抑制細(xì)胞增殖的作用。
6、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中,分別轉(zhuǎn)染miR-497 mimics(100nM)與miR-497 control,培養(yǎng)48h后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。與miR-497 control組相比,miR-497
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