miR-205-5p基因甲基化對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用初探.pdf

1、miRNA是一類由19~26個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過其“種子序列”識別并結合靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）從而調(diào)控基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系，然而，由于miR-205-5p基因的關鍵性甲基化調(diào)控位點存在爭議，致使miR-205-5p基因甲基化在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用仍有待明確。
　　目的：
　　確認miR-205-

2、5p基因的CpG島與關鍵CpG位點，建立甲基化特異性PCR定性分析方法，并通過在臨床標本中驗證其對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用，探索miR-205-5p基因甲基化作為分子標志物應用于臨床診斷的可能。
　　方法：
　　1、使用去甲基化藥物5’-AZA-CdR處理miR-205-5p表達差異的四株乳腺癌細胞（高表達細胞株MCF-7、T47D和低表達細胞株BT549、MDA-MB-231），使用qRT-PCR的方法檢測miR-205-5

3、p的表達；結合亞硫酸氫鈉克隆測序結果，篩選miR-205-5p基因關鍵性甲基化調(diào)控CpG位點；
　　2、設計靶向miR-205-5p基因關鍵性甲基化調(diào)控位點的MSP引物對乳腺癌細胞株進行定性分析，建立miR-205-5p基因甲基化特異性PCR方法；
　　3、miR-205-5p基因甲基化特異性PCR分別對乳腺良性病變、已發(fā)生轉移的乳腺癌及其癌旁組織、未發(fā)生轉移的乳腺癌標本進行定性分析，結合原位雜交miR-205-5p的表達分

4、析，探索miR-205-5p基因甲基化對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。
　　結果：
　　1、qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，5’-AZA-CdR處理后四組乳腺癌細胞中BT549與MDA-MB-231細胞miR-205-5p表達明顯增高，MCF-7與T47D細胞miR-205-5p表達無明顯變化。5’-AZA-CdR處理后，各細胞株中miR-205-5p基因編碼序列上游3739~-3640bp區(qū)段CpG島CpG位點總甲基化頻率

5、均降低；MCF-7和T47D細胞株各位點甲基化頻率與甲基化總頻率明顯低于BT549和MDA-MB-231細胞株；該CpG島中第2~6個CpG位點的甲基化狀態(tài)一致性較好，其中第2~3個CpG位點的甲基化狀態(tài)一致性頻率最高；
　　2、針對miR-205-5p基因編碼序列上游3739~-3640bp區(qū)段CpG島第2~3個CpG位點設計甲基化特異性MSP及USP引物，分別擴增未經(jīng)5’-AZA-CdR處理的BT549、MCF-7、MDA-M

6、B-231及T47D，結果顯示，U和M引物能特異性區(qū)分非甲基化和甲基化模板。經(jīng)5’-AZA-CdR處理的亞硫酸氫鈉修飾后模板中，BT549及MDA-MB-231去甲基化條帶增強；MCF-7甲基化條帶消失，去甲基化條帶增強；T47D在0和5μM處理組中都呈去甲基化狀態(tài)；
　　3、乳腺病變組織中miR-205-5p基因MSP分析結果顯示，已發(fā)生轉移的乳腺癌及其癌旁組織和未發(fā)生轉移的乳腺癌中miR-205-5p基因甲基化陽性率顯著高于良

7、性病變組織（P<0.01）；已發(fā)生轉移的乳腺癌、癌旁組織和未發(fā)生轉移的乳腺癌組織中的甲基化陽性率接近，無統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　1、miR-205-5p基因編碼序列上游3739~-3640bp區(qū)段為關鍵性CpG島區(qū)域，該區(qū)域的CpG位點甲基化狀態(tài)與miR-205-5p基因的表達密切相關。
　　2、靶向關鍵性CpG島區(qū)域的第2~3CpG位點設計的半甲基化MSP引物序列能特異性地區(qū)分miR-205-5p基因的甲基化狀