TRAF4通過泛素化降解E2F1抑制乳腺癌細胞凋亡.pdf

1、目的：
　　腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）是一組重要的銜接蛋白，主要存在于胞漿中。它們可與腫瘤因了壞死受體(TNFR)的胞漿部分及其他TRAF家族成員之間構(gòu)成二聚體或三聚體蛋白轉(zhuǎn)導復合物，參與調(diào)節(jié)NF-κ B，JNK等信號轉(zhuǎn)導通路，進而調(diào)控細胞的生物學功能。TRAF家族成員之間具有相似的結(jié)構(gòu)特征，即其羧基端具有TRAF同源結(jié)構(gòu)域，氨基端含有環(huán)指/鋅指結(jié)構(gòu)域，環(huán)指結(jié)構(gòu)域可以介導DNA-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，并

2、將信號向下游傳遞，近年來又發(fā)現(xiàn)TRAFs的環(huán)指結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶的活性，可以促進相關(guān)蛋白泛素化，進而調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導。
　　TRAF4是TRAF家族中特殊的一員，不與TNFR相結(jié)合，與其他TRAF家族成員之間也是微弱結(jié)合，在組織及細胞中TRAF4的定位和表達存在不同的觀點，不同研究證明其在細胞核、細胞漿和細胞膜中都有表達，但造成這種不同亞細胞定位的原因尚不明確。TRAF4在乳腺癌中存在過表達，我們實驗組在前期實驗中已經(jīng)證明，

3、在乳腺癌細胞中TRAF4能夠促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。它可以通過與PRMT5、p70s6k以及3-catenin的相互結(jié)合，激活NF-κB、mTOR和Wnt/β-catenin等信號通路促進乳腺癌細胞增殖，而對于凋亡機制的研究我們還了解甚少。
　　TRAF4與PRMT5能夠互相結(jié)合，并且我們認為TRAF4能夠上調(diào)PRMT5的表達，調(diào)節(jié)其下游信號。文獻報道具有凋亡活性的轉(zhuǎn)錄因子E2F1是精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT5的底物，在體外和腫

4、瘤細胞中PRMT5都能甲基化E2F1，并通過負調(diào)控E2F1促進細胞生長和抑制細胞凋亡。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)TRAF4能夠上調(diào)PRMT5，下調(diào)E2F1及其促凋亡下游基因p73，TRAF4對凋亡活性的調(diào)節(jié)與E2F1的表達密切相關(guān)，但深入研究證實TRAF4對E2F1的調(diào)節(jié)作用并不依賴于PRMT5的表達，我們發(fā)現(xiàn)TRAF4能夠與E2F1相互結(jié)合，并通過泛素化作用降解E2F1。
　　方法：
　　一、細胞培養(yǎng)
　　乳腺癌細胞MCF-

5、7應用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含10％胎牛血清），在37℃，5％CO2的孵箱內(nèi)進行孵育，每1-2天更換新鮮培養(yǎng)液，細胞長滿后，用0.25％胰酶消化進行傳代、鋪板處理。
　　二、主要試劑
　　兔抗人E2F1抗體，購自美國Proteintech公司，鼠抗人E2F1，TRAF4抗體，購自美國BD公司。兔抗人TRAF4抗體，羊抗人p73抗體，購自美國Santa CruzeBiotechnology。兔抗人PRMT5抗體，購自美國abcam

6、公司。鼠抗人HA標簽抗體，購自美國Cell Signalling Technology公司，鼠抗人GAPDH抗體，DAB酶底物顯色試劑盒和辣根酶標記羊抗兔，羊抗鼠，兔抗羊第二抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫沉淀相關(guān)Protein A+G agarose，蛋白酶體抑制劑MG-132、Westernblot及IP細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所。蛋白合成抑制劑(Cycloheximide)CHX，購自意大利inalco spa公

7、司。DMEM高糖、L15培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司。胰酶購自美國Invitrogen公司。
　　三、轉(zhuǎn)染
　　TRAF4野生型質(zhì)粒、HA-Ub質(zhì)粒來自Addgene(Cambridge，USA)，TRAF4-siRNA，E2F1-siRNA和PRMT5-siRNA由廣州銳博公司合成。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾分別根據(jù)Attractene轉(zhuǎn)染試劑和HiPerFect干擾試劑說明書進行。
　　四、細胞蛋白提取

8、　　PBS收取轉(zhuǎn)染或干擾48h的細胞，離心后((4℃，2000r,5min)，細胞沉淀內(nèi)加入細胞裂解液及相應比例的蛋白酶抑制劑，冰上裂解30min，高速離心(4℃，12000r，20min)，吸取上清，即為總蛋白。
　　五、Western blot
　　應用紫外分光光度計測取蛋白濃度后，將等量蛋白通過8％的SDS-PAGE進行蛋白分離，然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5％脫脂牛奶在室溫條件下封閉2h，特異性一抗4℃孵育過

9、夜，第二天用HRP標記的二抗室溫條件下孵育2h，隨后進行發(fā)光（ECL法），并進行條帶灰度值測定。
　　六、免疫共沉淀
　　取一定量含有總蛋白的細胞裂解液，加入1ug所需一抗和鼠/兔IgG4℃孵育過夜，第二天加入Protein A+G磁珠，4℃孵育4h，洗脫后收取免疫復合物進行westernblot檢測。
　　七、免疫熒光
　　24孔板玻片上的細胞經(jīng)4％多聚甲醛固定20min，使用0.2％tritonⅩ-100對細

10、胞核進行打孔15min，隨后用3％BSA封閉1h，加入特異性一抗，4℃孵育過夜，相應熒光二抗室溫孵育2h，并用DAPI對細胞核進行染色，熒光顯微鏡下觀察TRAF4與E2F1的定位情況。
　　八、細胞凋亡
　　轉(zhuǎn)染或干擾48h后收集1×105個細胞，根據(jù)凱基細胞凋亡試劑盒的說明書進行操作，使用流式細胞儀進行細胞凋亡分析。
　　九、統(tǒng)計分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)值以均值±標準差表示。

11、應用t檢驗和單因素方差進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗至少重復三次。p＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　一、TRAF4能夠抑制乳腺癌細胞凋亡
　　在乳腺癌細胞系MCF-7中雙向調(diào)控TRAF4，流式細胞分析顯示TRAF4能夠抑制乳腺癌細胞凋亡。
　　二、TRAF4通過下調(diào)E2F1抑制乳腺癌細胞凋亡，但不依賴PRMT5
　　在MCF-7細胞中TRAF4能夠上調(diào)PRMT5，下調(diào)E2F1及其下游靶基因p73的表

12、達。而下調(diào)TRAF4表達的同時干擾了E2F1時，發(fā)現(xiàn)下調(diào)E2F1明顯抑制了下調(diào)TRAF4后對p73及細胞凋亡率的上調(diào)作用。由此得出結(jié)論，TRAF4可以通過下調(diào)E2F1的表達抑制乳腺癌細胞凋亡，p73在其中發(fā)揮重要作用。
　　然而，在MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染TRAF4的同時干擾PRMT5后，E2F1的表達水平仍然呈現(xiàn)明顯減少的趨勢，提示我們TRAF4下調(diào)E2F1表達的作用并不依賴PRMT5。
　　三、TRAF4通過泛素化作用降解E

13、2F1
　　免疫熒光結(jié)果顯示在MCF-7細胞中TRAF4與E2F1存在相同的定位，并且免疫共沉淀結(jié)果顯示二者能夠互相結(jié)合。使用放線菌酮結(jié)果顯示TRAF4能夠衰減E2F1蛋白的半衰期。蛋白酶體相關(guān)實驗顯示TRAF4能夠通過泛素化途徑降解E2F1。
　　結(jié)論：
　　在乳腺癌細胞MCF-7中TRAF4與E2F1存在共定位，并二者能夠相互結(jié)合，TRAF4可以通過泛素化作用降解E2F1，并下調(diào)其表達水平，從而發(fā)揮其抑制凋亡的活性