乳腺癌中TRAF4通過上調(diào)β-catenin的表達(dá)活化和促進(jìn)β-catenin核定位參與Wnt信號(hào)通路.pdf

1、前言：
　　TRAF4是TRAF家族的一個(gè)成員。TRAF4的功能并不像其他的TRAF家族成員，其功能仍然不清楚。β-catenin在乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生的過程中起到了重要的作用。β-catenin是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子。Razon LM和El-Diery WS，通過酵母雙雜交篩選，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TRAF4和β-catenin之間的相互作用，并且TRAF4似乎可以增強(qiáng)β-catenin的相關(guān)轉(zhuǎn)錄，以及保護(hù)β-catenin蛋白兔于被p

2、53基因的介導(dǎo)的降解途徑降解。這是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)，我們考慮TRAF4是否可以通過β-catenin影響Wnt信號(hào)通路。我們回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，TRAF4對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響在非洲爪蟾胚胎組織是可以忽略的。但是，TRAF4是否與Wnt信號(hào)通路在腫瘤組織中有關(guān)系，例如乳腺癌組織，仍不清楚。此外，TRAF4最初被鑒定為在乳腺癌中擴(kuò)增的基因，促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和乳腺癌轉(zhuǎn)移，這些功能很像β-catenin參與的功能。還有一個(gè)原因是，TRAF4可以調(diào)節(jié)N

3、F-κB活化，Wnt信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路之間存在交叉調(diào)控。
　　出于這些原因，我們研究TRAF4與β-catenin在乳腺癌中的表達(dá)相關(guān)性和TRAF4對(duì)β-catenin的亞細(xì)胞分布和相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制的影響，并進(jìn)一步確定在乳腺癌細(xì)胞中TRAF4和Wnt信號(hào)通路之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1、免疫組化
　　分析78例乳腺癌組織中TRAF4與β-catenin的表達(dá)相關(guān)性。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　

4、正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。
　　3、免疫共沉淀
　　檢測(cè)TRAF4與β-catenin的結(jié)合狀況。
　　4、免疫熒光染色
　　檢測(cè)TRAF4與β-catenin的核漿定位及其共定位。
　　5、轉(zhuǎn)染
　　按照Attractene轉(zhuǎn)染試劑或HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　6、Western blo

5、t
　　應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染TRAF4前后，β-catenin的變化:檢測(cè)干擾TRAF4前后β-catenin的變化和細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin的變化。
　　7、MTT
　　分析細(xì)胞的相對(duì)增殖能力。
　　8、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、TRAF4與β-cate

6、nin在乳腺癌中表達(dá)呈正相關(guān)
　　免疫組化分析結(jié)果顯示，TRAF4與β-catenin在乳腺癌組織中表達(dá)。TRAF4在乳腺組織中呈細(xì)胞核和細(xì)胞漿表達(dá)，β-catenin呈細(xì)胞膜，細(xì)胞漿和細(xì)胞核表達(dá)。在乳腺癌中TRAF4的表達(dá)與β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　2、在乳腺癌中TRAF4與β-catenin相互作用
　　免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)，TRAF4與β-catenin在乳腺癌細(xì)胞中相結(jié)合。免疫熒光分析

7、說明TRAF4與β-catenin在乳腺癌細(xì)胞中存在共定位，并驗(yàn)證了TRAF4和β-catenin乳腺癌細(xì)胞中的定位。
　　3、在乳腺癌中TRAF4促進(jìn)β-catenin蛋白的表達(dá)和活化
　　在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)TRAF4后，β-catenin和活化β-catenin的表達(dá)量增加。在MCF-7細(xì)胞中，上調(diào)TRAF4后β-catenin蛋白總量不變，但是活化的β-catenin表達(dá)增加。
　　4、在乳腺癌中T

8、RAF4促進(jìn)β-catenin蛋白的核定位
　　免疫熒光分析MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)TRAF4和下調(diào)TRAF4后，β-catenin的細(xì)胞定位。結(jié)果表明TRAF4表達(dá)上調(diào)后，β-catenin細(xì)胞核定位增加。Western blot分別分析MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)TRAF4后細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)增加。
　　5、在乳腺癌細(xì)胞中TRAF4通

9、過調(diào)節(jié)β-catenin蛋白參與Wnt信號(hào)通路
　　CyclinD1和c-myc是Wnt信號(hào)通路的下游靶蛋白，TRAF4上調(diào)后cyclinD1和c-myc表達(dá)增加，TRAF4表達(dá)下調(diào)后cyclinD1和c-myc表達(dá)下調(diào)。在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)TRAF4后干擾掉β-catenin可以發(fā)現(xiàn)cyclinD1和c-myc的表達(dá)不增加，這說明TRAF4通過β-catenin調(diào)節(jié)cyclinD1和c-myc。
　　6、TRA

10、F4通過調(diào)節(jié)β-catenin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖
　　TRAF4可以促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞增殖，但是當(dāng)上調(diào)TRAF4表達(dá)的同時(shí)下調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)以后，TRAF4促進(jìn)細(xì)胞增殖能力減弱。說明TRAF4通過β-catenin促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　7、在MCF-7細(xì)胞中，下調(diào)β-catenin蛋白不影響TRAF4表達(dá)
　　在MCF-7細(xì)胞中，下調(diào)β-catenin表達(dá)后，TRAF4表達(dá)量不變。說明β-c