2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、1前言:
  乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤,全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始一直呈上升的趨勢,乳腺癌已經成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題[1-4]。乳腺并不是維持人體生命活動的重要器官,原位乳腺癌并不致命,但是由于乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性,細胞之間的連接松散,容易脫落。癌細胞一旦脫落,游離的癌細胞可以隨著血液和淋巴液播散全身,形成轉移,危機生命[5-9]。隨著生活水平的提高,人們對于自己的生活質量的追求不斷提升

2、,對乳腺癌的治療不僅希望保證生命安全,也對自身的形象有更高的要求。因此尋找和鑒定乳腺癌的特異性分子標記物,對于早期診斷和治療乳腺癌至關重要。
  TRIM(tripartite-motif protein)蛋白家族的名稱是由于其具有三個保守的結構域而得來的[10,11]。TRIM蛋白家族由100多個成員組成,其中人類基因組已經發(fā)現和鑒定出70個TRIM蛋白成員[10-12]。TRIM家族蛋白在生物體生長發(fā)育過程中有兩項最主要的生物

3、學功能:其一是通過干擾病毒的復制過程而發(fā)揮其抗病毒的功能[13-15];其二是發(fā)揮模式識別受體的功能,識別病毒的衣殼蛋白,調控生物體的天然免疫系統(tǒng)[16-19]。近年來多項研究表明TRIM蛋白家族成員參與調控細胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[20-25]。大量研究表明,TRIM家族蛋白與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。TRIM24在肝癌[26]、乳腺癌[27]、前列腺癌[27]等腫瘤中的表達發(fā)生異常,即可發(fā)揮促癌基因的作

4、用,也可發(fā)揮抑癌基因的作用。TRIM28在直腸癌組織中過量表達,并且與患者的不良預后情況顯著相關,發(fā)揮重要的原癌基因功能。TRIM28在腸癌中過表達水平與低表達的p53顯著相關,且TRIM28高表達與患者總生存期和無進展生存期的縮短密切相關[28]。TRIM27在人宮頸癌細胞中過表達,使得腫瘤細胞對化療藥物順鉑產生抵抗性[29]。在卵巢癌患者組織中同樣檢測到了TRIM27的過表達現象,并且其過表達水平與化療耐藥性呈正相關[30]。最近有

5、研究發(fā)現TRIM59在多種腫瘤中表達升高,但其臨床意義和具體作用機制尚不明確。
  本研究旨在探討TRIM59蛋白在乳腺癌組織中的表達情況及臨床意義。另外,我們還研究了TRIM59對乳腺癌細胞增殖、侵襲、細胞周期、凋亡等生物學行為產生的影響及其分子機制。
  2、材料與方法:
  2.1、組織樣本
  乳腺癌組織以及相應癌旁正常組織取自于在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院診斷為乳腺癌并接受手術切除治療的患者。本研究經過中

6、國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理學會的批準。
  2.2、細胞培養(yǎng)
  MCF-10A, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT474, BT594, T47D, MCF7, ZR-75-1以及SK-BR-3細胞系購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。培養(yǎng)細胞所用培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基,其中包含10%胎牛血清,100 ug/ml的鏈霉素以及100U/ml青霉素。培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2。
  

7、2.3、細胞轉染與干擾
  轉染所用質粒pCMV6-TRIM59以及空載質粒購買于美國的Origene公司,轉染試劑Attractene transfection reagent購買于德國Qiagen公司。干擾所用SMARTpool siRNATRIM59以及陰性對照Non-targeting siRNA購買于美國Dharmacon公司。干擾試劑Dharmafectl reagent購買于美國Dharmacon公司。
  2

8、.4、免疫組織化學
  腫瘤組織首先經過包埋,并制備4μm厚度的樣片。本實驗過程所用一抗為trim59,使用稀釋比例為1∶200。過氧化物酶反應用DAB plus試劑盒,復染使用蘇木精染色液,封片前用濃度梯度酒精進行脫水。兩位病理專家對所有樣本進行隨機檢測,每個樣本隨機選取5個視野,每個視野在放大400倍條件下均可觀察到100個細胞。
  2.5、 Western blot
  本實驗所用抗體有TRIM59、cycli

9、n E/A/B、p-AKT、AKT、bcl-2、bcl-xl、 p53、 p21、p27(cell signaling technology)、GAPDH(Santa Cruz,USA),辣根過氧化物酶耦合的二抗(Abcam,USA)。RIPA細胞裂解液中包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。蛋白定量使用BCA蛋白定量試劑盒。
  2.6、 RNA提取以及RT-PCR
  樣本總RNA的提取使用Trizol試劑。實時熒光定量PCR

10、實驗使用SYBR Greenmaster mix試劑盒。PCR實驗所用儀器為7500 Real-Time PCR System。內參基因使用β-actin。目的基因的擴增倍數的測算方法依據2-△△Ct。本實驗重復3次。
  2.7、細胞增殖實驗
  MTT實驗:細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,接種密度約為每孔5×103個細胞,連續(xù)培養(yǎng)5天。每孔加入20μl5 mg/ml MTT溶液,并繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)基去除,每

11、孔加入150μl DMSO。用酶標儀進行檢測,檢測波長為490nm。集落形成實驗:細胞接種于直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿,接種密度約為1000個/皿。細胞連續(xù)培養(yǎng)2周,用PBS緩沖液漂洗細胞表面,并用吉薩姆染色液進行染色。在光學顯微鏡下進行觀察,超過50個細胞的集落即可進行計數。
  2.8、細胞轉移和侵襲實驗
  細胞侵襲實驗用24孔Transwell小室。將稀釋后的細胞懸液加入到transwell上室中,下室加入含15%胎

12、牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于37℃條件下培養(yǎng)16小時。將未闖過基質膠的細胞用棉簽輕輕擦去,將穿過基質膠的細胞用4%多聚甲醛進行固定,用蘇木精進行染色。隨機選取5個視野并在顯微鏡下進行計數。
  2.9、流式細胞術
  收集經過轉染及干擾的細胞,并用PBS緩沖液漂洗細胞。用250μl的緩沖液將細胞進行重懸,并用1%多聚甲醛進行固定。固定后加入5 mg/ml碘化丙啶或者5 mg/ml碘化丙啶及AnnexinⅤ/FITC。黑暗條件下

13、染色15分鐘后將細胞應用于流式細胞儀,分別分析細胞的周期和凋亡水平。
  2.10、統(tǒng)計分析
  數據統(tǒng)計分析所用軟件為SPSS16.0。分析trim59的表達模式與臨床病理因素之間的關系采用卡方檢驗法。其他處理組與對照組之間所得數據采用Student's t檢驗方法進行分析。P<0.05表示兩組之間存在顯著差異。
  3、結果:
  3.1、 TRIM59在乳腺癌組織中表達升高
  我們通過免疫組化的方法

14、檢測了95例乳腺癌組織和15例正常乳腺組織中TRIM59蛋白的表達情況。TRIM59主要在細胞漿和細胞膜上表達。參考文獻報道[31],我們根據其染色強度和染色范圍,將染色分為4個等級。0分:0/0(強度/范圍);1分:弱漿染色和/或≤25%漿染色;2分:中等強度漿染色和/或≤50%漿染色;3分:強漿染色和/或≥50%漿染色。其中0分和1分為低表達,2分和3分為高表達。95例乳腺癌組織中,TRIM59高表達比率為44.1%(42/95)。

15、在15例正常乳腺上皮中TRIM59表達為陰性或弱表達。以上結果說明,TRIM59在乳腺癌組織中高表達。
  3.2、 TRIM59在乳腺癌中的臨床意義
  TRIM59在乳腺癌組織中顯著上調與腫瘤較高的TNM分期(p=0.0056)以及淋巴結轉移(p=0.0088)密切相關。但與患者的年齡(p=0.5226),腫瘤的大小(p=0.6160)無顯著相關性。此外,TRIM59的高表達與乳腺癌患者雌激素受體缺失(p=0.0197)

16、和和孕激素受體缺失(p=0.0215)顯著相關。TRIM59在三陰性乳腺癌組織中的表達水平明顯高于非三陰性乳腺癌組織(p=0.0157)。采用Kaplan-Meier統(tǒng)計方法分析TRIM59表達水平與乳腺癌患者生存時間之間的關系。結果表明TRIM59表達量較高的患者生存時間低于TRIM59表達量較低的患者。
  3.3、 TRIM59在乳腺癌細胞中的表達以及TRIM59轉染與干擾
  通過Western blot檢測TRIM

17、59在正常乳腺上皮細胞(MCF-10A)和乳腺癌細胞系(MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT474, BT594, T47D, MCF-7, ZR-75-1,SK-BR-3)中的內源表達水平。結果顯示,在正常乳腺上皮細胞MCF-10A中,TRIM59表達缺失。乳腺癌細胞系中,MDA-MB-453、BT474以及SK-BR-3細胞中TRIM59的表達水平較高,而BT594、MCF-7以及T47D細胞中TRIM59的表達水平

18、較低。分別選擇內源表達量較低的MCF-7細胞和內源表達量較高的SK-BR-3細胞進行TRIM59的轉染和干擾實驗,并通過western blot方法分析轉染以及干擾效率。結果顯示轉染TRIM59后,MCF-7細胞中TRIM59的蛋白表達量顯著提高;而敲除TRIM59基因后,SK-BR-3細胞中TRIM59的蛋白表達量則明顯降低。
  3.4、 TRIM59促進乳腺癌細胞增殖
  將轉染以及干擾TRIM59的乳腺癌細胞分別應用

19、于MTT實驗和集落形成實驗。MTT結果顯示: TRIM59過表達后,MCF-7細胞的增殖率提高;而敲除TRIM59后,SK-BR-3細胞的增殖率降低。集落形成實驗結果顯示,TRIM59過表達后,MCF-7細胞形成的集落數目增加(155±8.5 VS328±24);而敲除TRIM59后,SK-BR-3細胞形成的集落數目減少(250±16.2 VS120±12.1)。
  3.5、 TRIM59促進乳腺癌細胞的侵襲
  我們將經

20、過TRIM59轉染以及干擾的乳腺癌細胞系應用于劃痕實驗和基質膠侵襲實驗以分析TRIM59對乳腺癌細胞轉移和侵襲能力發(fā)揮的作用。劃痕實驗結果表明:MCF-7細胞中,TRIM59過表達使得乳腺癌細胞48小時的遷移距離較對照組明顯增加(62.6±3.1 VS93.6±4.2);而在SK-BR-3細胞中,TRIM59表達缺失則導致乳腺癌細胞48小時的遷移距離較對照組減少(112.3±3.7 VS81±5.2)?;|膠侵襲實驗表明TRIM59能夠

21、促進乳腺癌細胞侵襲。在MCF-7細胞中,TRIM59過表達使得乳腺癌細胞穿膜數目增加(41.6±V5.5S75.3±4.5);而在SK-BR-3細胞中,TRIM59表達缺失則導致乳腺癌細胞穿膜數目減少(97.6±6.1 VS52.6±5.8)。
  3.6、 TRIM59促進乳腺癌細胞進展
  通過流式細胞術分析經過TRIM59轉染以及siRNA TRIM59干擾該基因的乳腺癌細胞的周期變化。實驗結果顯示,TRIM59過表達

22、后,MCF-7細胞的S期所占比例升高((S:22.6±1.2 VS31±1.1),G2期所占比例降低;(G2:39.2±0.9 VS30.6±1.4)。而在SK-BR-3細胞中,TRIM59表達缺失使得細胞S期所占比例降低(S:6.1±0.5 VS3.1±0.3),G2期所占比例升高(G2:8.2±0.6 VS10.7±0.7)。
  3.7、 TRIM59增強乳腺癌細胞的化療耐藥性
  將經過TRIM59轉染以及干擾的細胞

23、用順鉑進行干預,誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,并通過流式細胞術分析細胞的凋亡水平變化。結果顯示:TRIM59過表達后,由順鉑誘導的細胞凋亡率較對照組明顯降低(21.2±1.3VS12.7±1.1);而在SK-BR-3細胞中,TRIM59表達缺失后由順鉑誘導的細胞凋亡率較對照組明顯升高(10.8±0.9 VS17.6±1.3)。
  3.8、 TRIM59調控乳腺癌細胞中周期和凋亡相關蛋白
  通過western blot方法檢測分析

24、了細胞中與周期、凋亡相關指標的表達水平變化。結果顯示TRIM59過表達可上調乳腺癌細胞MCF-7中cyclinA,cyclinB,cyclinE,bcl-xl,bcl-2的表達水平,同時下調p21,p27的表達水平。而在敲除TRIM59基因后,SK-BR-3細胞中cyclinA,cyclinB,cyclinE,bcl-xl,bcl-2的表達量下調,同時p21,p27的表達量上調。
  3.9、 TRIM59抑制caspase的剪切

25、和cytochrome c的釋放
  通過western blot方法檢測細胞中與細胞程序性凋亡相關指標的表達水平變化。實驗結果表明,TRIM59過表達后,MCF-7細胞中cleaved-caspase3,cleaved-caspase9,cleaved-caspase PARP的表達量均顯著降低;而在SK-BR-3細胞中敲除TRIM59基因后,cleaved-caspase3,cleaved-caspase9,cleaved-c

26、aspase PARP的表達量顯著上調。此外,在TRIM59高表達的MCF-7細胞中還檢測到了cytochrome c的表達量較對照組下調,而在SK-BR-3細胞中,TRIM59表達缺失則導致cytochrome c表達量上調。
  3.10、 TRIM59下調乳腺癌細胞中p53水平并上調p-AKT水平
  檢測了細胞中多條信號通路的變化水平,發(fā)現TRIM59過表達可激活AKT信號通路,上調p-AKT的表達量;而使用siRN

27、A敲除TRIM59基因后,SK-BR-3細胞中p-AKT的表達量的表達量下調。此外,TRIM59過表達可下調MCF-7細胞中p53的表達量,而TRIM59表達缺失則上調細胞中p53的表達量。
  3.11、 TRIM59促進乳腺癌細胞中p53的泛素化過程
  免疫共沉淀實驗結果表明乳腺癌細胞中TRIM59過表達可促進p53的泛素化過程。
  4、結論:
  乳腺癌組織中TRIM59過表達并與腫瘤較高的TNM分期以

28、及淋巴結轉移密切相關。TRIM59的高表達與乳腺癌患者雌激素受體缺失(p=0.0197)和孕激素受體缺失(p=0.0215)顯著相關。TRIM59在三陰性乳腺癌組織中的表達水平明顯高于非三陰性乳腺癌組織(p=0.0157)。TRIM59表達量較高的患者生存時間低于TRIM59表達量較低的患者。
  TRIM59過表達可促進乳腺癌細胞增殖、轉移、侵襲及周期進展,并增強細胞對順鉑的化療抵抗性。TRIM59過表達激活乳腺癌細胞中的AKT

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