Notch1通過(guò)上調(diào)MCAM-CD146表達(dá)促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及化療耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、目前，乳腺癌已成為影響全球女性健康和生活質(zhì)量最常見的惡性腫瘤。腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療抵抗和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌復(fù)發(fā)，以及最終導(dǎo)致死亡的重要原因。研究認(rèn)為，發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵起始步驟。EMT過(guò)程往往伴隨著遷移、侵襲能力以及細(xì)胞干性的增強(qiáng)，且對(duì)放化療的敏感性下降。近來(lái)的研究顯示，Notch信號(hào)通路和惡性黑色素瘤粘附分子（MCAM/CD146）均與乳腺癌EMT關(guān)系密切，然而，在乳腺癌中，兩者之間是否存在調(diào)控關(guān)系，尚未明確。本

2、研究旨在通過(guò)分子機(jī)制、細(xì)胞功能、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床意義等不同層面探索乳腺癌中Notch信號(hào)通路與 MCAM/CD146的調(diào)控關(guān)系，以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞 EMT，遷移，浸潤(rùn)，增殖和對(duì)順鉑敏感性等一系列功能的影響。
　　首先，在不同的乳腺癌細(xì)胞系中分析 Notch1，2，3，4和 MCAM及主要 EMT標(biāo)記物E-cadherin及Vimentin的表達(dá)及定位情況。采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western-blot

3、）的方法分析雌激素受體-α（ERα）陽(yáng)性的管腔上皮分子亞型（luminnal subtype）細(xì)胞系MCF7，T47D，HER-2亞型細(xì)胞系SKBR3，以及雌激素受體-α（ERα）陰性的基底樣分子亞型（basal-like subtype）乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和BT549中Notch1，2，3，4和MCAM的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在mRNA還是蛋白水平，Notch1和Notch2在ERα陰性細(xì)胞系DA-MB-231、BT5

4、49和ERα陽(yáng)性細(xì)胞系T47D， MCF7中均有表達(dá)，而且差異不明顯。Notch3在ERα陽(yáng)性細(xì)胞系T47D，MCF7中表達(dá)較高，而在ERα陰性的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、BT549和SKBR3中，Notch3表達(dá)水平相對(duì)較低。Notch4和MCAM在ERα陰性的乳腺癌細(xì)胞系SKBR3、BT549、MDA-MB-231中高表達(dá)，而在ERα陽(yáng)性細(xì)胞系MCF7，T47D中表達(dá)水平相應(yīng)較低。通過(guò)免疫熒光的方法分析MDA-MB-231和

5、MCF7中Notch1，2，3，4和MCAM的表達(dá)，結(jié)果顯示Notch1，2，3，4在細(xì)胞中的定位主要在細(xì)胞核，而MCAM的表達(dá)主要位于細(xì)胞膜，細(xì)胞漿中也有少部分表達(dá)。
　　接著，分析乳腺癌細(xì)胞中Notch1，2，3，4和MCAM是否存在調(diào)控關(guān)系。利用 RNA干擾技術(shù)，在乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231中沉默內(nèi)源性的 Notch1，2，3，4的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch1的表達(dá)水平顯著下降后，MCAM的表達(dá)也出現(xiàn)同樣的下降趨勢(shì)。

6、而過(guò)表達(dá) Notch1后，MCAM的表達(dá)相應(yīng)的上升。該結(jié)果表明，在乳腺癌細(xì)胞中，Notch1對(duì)MCAM有正向調(diào)控的作用，這種調(diào)控關(guān)系在mRNA水平與蛋白水平的變化趨勢(shì)一致。
　　進(jìn)一步分析了MCAM的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其序列上有2個(gè)Notch1對(duì)下游基因調(diào)控的核心序列（CSL binding element），分別位于MCAM啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-3500bp和-477bp的位置。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Notc

7、h1可直接結(jié)合MCAM的啟動(dòng)子區(qū)，并且通過(guò)凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA），明確含有CSL binding site的MCAM啟動(dòng)子在體外能與 Notch1結(jié)合。雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，乳腺癌細(xì)胞中Notch1-ICD能夠驅(qū)動(dòng)MCAM啟動(dòng)子的活性，而這種調(diào)控效應(yīng)是通過(guò)結(jié)合在MCAM啟動(dòng)子上CSL binding site核心序列起作用的。
　　近期乳腺癌的研究中提示，Notch1和MCAM均有獨(dú)立促進(jìn)EMT的作用。因此，進(jìn)一步通

8、過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)，分析 MCAM是否在 Notch1調(diào)控 EMT過(guò)程中起介導(dǎo)作用。在MDA-MB-231細(xì)胞系和BT549細(xì)胞系中分別沉默Notch1，或是沉默Notch1的基礎(chǔ)上再過(guò)表達(dá)外源性MCAM，并與對(duì)照處理的MDA-MB-231細(xì)胞系和BT549比較，通過(guò)蛋白免疫印跡、浸潤(rùn)、遷移和克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這兩種細(xì)胞系中，Notch1表達(dá)降低后，MCAM的表達(dá)也下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin表達(dá)也相應(yīng)降低，而腔上皮細(xì)胞標(biāo)志E-c

9、adherin的表達(dá)則上升，細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和克隆形成能力明顯下降；重新過(guò)表達(dá)外源性MCAM的表達(dá)后，Vimentin的表達(dá)隨之上升，E-cadherin表達(dá)則下降，細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)和克隆形成能力增強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明，乳腺癌細(xì)胞株中，抑制Notch1/MCAM信號(hào)通路可以抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低乳腺癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和增殖潛能?；诩?xì)胞水平研究的結(jié)果，我們進(jìn)一步建立裸鼠異體原位移植瘤模型，也同樣證明在裸鼠體內(nèi)， Notch1/MCAM信號(hào)通路

10、可以影響乳腺癌細(xì)胞成瘤能力。
　　另外，檢測(cè)到順鉑耐藥乳腺癌細(xì)胞株（DDP-R-MDA-MB-231）中 Notch1和MCAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于野生型（MDA-MB-231）的表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明，抑制Notch1/MCAM信號(hào)通路能降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，其機(jī)制可能部分通過(guò)影響AKT信號(hào)通路的活性。
　　采用TCGA（the Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)中人乳腺癌組織標(biāo)本

11、進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示，Notch1和MCAM的mRNA表達(dá)水平高度正相關(guān)，即Notch1高表達(dá)， MCAM也高表達(dá)。而且，Notch1和MCAM在ERα陰性或basal-like亞型乳腺癌組織中的表達(dá)水平均顯著高于 ERα陰性或 basal-like亞型乳腺癌組織。我們用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè)52例三陰性乳腺癌標(biāo)本中Notch1和MCAM的表達(dá)狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Notch1和MCAM兩者之間的表達(dá)水平也呈高度正相關(guān)，與TCG

12、A數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果一致。我們利用Kaplan-Meier plotter臨床基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，基底樣分子亞型乳腺癌患者中，Notch1和MCAM的mRNA表達(dá)高低均與無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著（RFS）相關(guān)。Notch1或MCAM mRNA表達(dá)水平高的患者，RFS較短。而且，接受過(guò)化療的basal-like分子亞型乳腺癌患者，Notch1或MCAM mRNA高表達(dá)，其無(wú)復(fù)發(fā)生存率均更短。
　　綜上所述，本研究的一系

13、列結(jié)果說(shuō)明，不同分子亞型的乳腺癌細(xì)胞中Notch1均高表達(dá)， MCAM則主要高表達(dá)于 ERa陰性的乳腺癌細(xì)胞中。在 ERa陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和BT549中，Notch1能夠通過(guò)直接轉(zhuǎn)錄上調(diào)MCAM的表達(dá)而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。抑制Notch1/MCAM信號(hào)通路能夠降低乳腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，抑制遷移，浸潤(rùn)和增殖，并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。乳腺癌患者 Notch1和 MCAM表達(dá)水平高，其預(yù)后差，并可能對(duì)化療產(chǎn)生耐藥