雌激素通過Shh-Gli通路對乳腺癌干細胞特性和上皮間質轉化調控機制的研究.pdf

1、目的：
　　研究雌激素、Sonichedgehog(Shh)/Gli信號通路對乳腺癌干細胞(BCSCs)和細胞上皮間質轉化(EMT)的作用及其生物學意義，探討雌激素對乳腺癌細胞Shh/Gli通路影響、對乳腺癌干細胞干性及EMT的作用，通過特異性阻斷Shh/Gli信號通路，觀察對BCSCs和EMT的影響，探討乳腺癌發(fā)病機制和新的靶向治療方法。
　　方法：
　　逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測20種乳腺癌細胞系中雌激

2、素受體(ER)、Shh信號通路轉錄因子Gli1和BCSCs標記物ALDH1的表達并分析其相關性;Westernblot和免疫熒光檢測MCF-7、HCC1428、MDA-MB-231和BT549細胞系ER的表達;將4種乳腺癌細胞系分別分為酒精對照組、10nM雌二醇組和10nM雌二醇+1μM他莫昔芬組，Westernblot和RT-PCR檢測Gli1表達;MCF-7和HCC1428細胞系分別轉染空質粒(shVEC)和Gli1干擾質粒（shG

3、li1-1和shGli1-2），加入酒精或雌二醇培養(yǎng)，用流式細胞術、mammosphere形成和Westernblot檢測BCSCs干性的改變，劃痕實驗、Matrigel侵襲實驗和Westernblot檢測對乳腺癌細胞上皮間質轉化的影響;用不同濃度雌二醇處理乳腺癌細胞系后，RT-PCR和Westernblot檢測Gli1、Shh和ALDH1的表達。免疫組化檢測組織芯片ER、Gli1和ALDH1表達并分析相關性。
　　結果：

4、　　1.20種乳腺癌細胞系中ER、Gli1和ALDH1mRNA均表達，但表達水平不同，線性分析顯示ER的表達分別與Gli1和ALDH1呈正相關(r=0.845，p＜0.01;r=0.385，p＜0.05)。
　　2.用雌二醇處理后，ER陽性細胞系(MCF-7、HCC1428)Gli1蛋白水平較對照組明顯升高，聯合他莫昔芬處理后，Gli1表達降低;在同樣2個實驗處理組中ER陰性細胞系（MDA-MB-231、BT549）Gli1表達無

5、明顯改變，說明雌激素只能在ER陽性乳腺癌細胞系中激活Shh/Gli1通路。
　　3.MCF-7和HCC1428分別轉染shVEC、shGli1-1和shGli1-2，經雌二醇處理后，Westernblot和RealtimeRT-PCR檢測MCF-7和HCC1428細胞中BCSCs相關標記物ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋白和mRNA水平的表達，shVEC細胞經雌二醇處理后ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋

6、白和mRNA表達水平明顯升高，shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組與酒精對照組比較，ALDH1、Nanog、SOX2和Bmi-1蛋白和mRNA表達水平無明顯變化，明顯低于shVEC組（**或＃＃P＜0.01）。流式細胞術檢測表達具有干細胞標記CD44+/CD24-/low亞型細胞的比例，shVEC細胞經雌二醇處理后表達CD44+/CD24-/low的細胞比例明顯升高，shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組與酒精對照組比

7、較，CD44+/CD24-/low細胞比例變化不大，都明顯低于shVEC組（**或＃＃P＜0.01）。相似的結果也在mammosphere形成實驗得到驗證，shVEC細胞的雌二醇處理組mammosphere的數量和體積都明顯高于shVEC酒精對照組，shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組和酒精對照組mammosphere的數量和體積無明顯變化，都明顯低于shVEC組（**或＃＃P＜0.01）。
　　4.隨著雌二醇濃度的增加

8、，Gli1和ALDH1的mRNA和蛋白表達水平逐漸升高，Shh的表達無明顯變化，說明在ER陽性乳腺癌細胞中，雌激素通過Shh/Gli通路的配體非依賴的途徑激活Gli1調控BCSCs（*P＜0.05，**P＜0.01）。
　　5.MCF-7和HCC1428分別轉染shVEC、shGli1-1和shGli1-2，shVEC細胞經雌二醇處理后細胞發(fā)生EMT，其遷移和侵襲能力均增強;shGli1-1和shGli1-2雌二醇處理組細胞不發(fā)生

9、EMT，與酒精對照組比較遷移和侵襲能力變化不大;與shVEC相比，shGli1-1和shGli1-2細胞的遷移和侵襲能力明顯下降（**或＃＃P＜0.01）。
　　6.組織芯片檢測10例正常乳腺組織Gli1和ALDH1低表達，100例乳腺癌組織中Gli1和ALDH1的表達升高。線性分析乳腺癌組織ER與Gli1、ALDH1的關系，顯示ER的表達分別與Gli1和ALDH1呈正相關(r=0.713，p＜0.01;r=0.476，p＜0.0