雌激素介導(dǎo)的Wnt-β-catenin信號(hào)通路調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　?。?）研究子宮內(nèi)膜異位癥中是否存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象；
　?。?）研究雌激素在內(nèi)異癥EMT發(fā)生中的作用以及Wnt/β-catenin通路在雌激素促進(jìn)內(nèi)異癥EMT發(fā)生中的作用；
　　（3）探討雌激素介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥EMT的分子機(jī)制。
　　方法：
　?。?）收集明確診斷內(nèi)異癥患者的在位和異位子宮內(nèi)膜以及單純因輸卵管因素的不孕癥患者子宮內(nèi)膜（對(duì)照組），利用免疫組

2、織化學(xué)方法檢測(cè)EMT分子標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及核轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail在內(nèi)異癥在位（EU）和異位子宮內(nèi)膜（EC）以及正常子宮內(nèi)膜（NOR）中定位表達(dá)情況；
　?。?）QRT-PCR和Western blotting檢測(cè)內(nèi)異癥患者EU和EC以及NOR中EMT分子標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及核轉(zhuǎn)錄因子β-catenin和Snail

3、的表達(dá)；
　?。?）分離、培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞（Endometrial epithelial cells，EECs）；以不同濃度（10-6、10-8mol/L）17β-雌二醇作用EECs48h，qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)上皮細(xì)胞EMT標(biāo)記物E-cadherin，間質(zhì)表型標(biāo)記物N-cadherin和E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的表達(dá)以及去磷酸化β-catenin的表達(dá)；光鏡下觀察細(xì)胞的

4、形態(tài)變化；檢測(cè)EECs體外粘附、侵襲與遷移能力；
　?。?）分離、培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞（Endometrial epithelial cells，EECs），10-6mol/L17β-雌二醇作用 EECs48h，免疫熒光檢測(cè)β-catenin的入核情況；Western blotting檢測(cè)上皮細(xì)胞去磷酸化β-catenin的表達(dá)；
　?。?）高分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞，即Ishikawa細(xì)胞代替EECs。以不同濃度（10

5、-6、10-8 mol/L）17β-雌二醇作用Ishikawa細(xì)胞48h，qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞EMT標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin和E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail以及去磷酸化β-catenin的表達(dá)；
　?。?）利用siRNA靶向沉默Ishikawa細(xì)胞的β-catenin基因以阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，以10-6mol/L17β-雌二

6、醇作用48h，Western blotting檢測(cè) EMT標(biāo)記分子物E-cadherin，間質(zhì)表型標(biāo)記物N-cadherin以及E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的表達(dá)；檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞體外粘附、侵襲與遷移能力；
　?。?）分別構(gòu)建Snail啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體，在Ishikawa細(xì)胞中應(yīng)用共轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶方法（Dual-luciferase Assay）分析β-catenin TCF/LEF對(duì)Snail基

7、因靶啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性的影響；染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation）實(shí)驗(yàn)研究β-catenin/TCF/LEF對(duì)Snail基因啟動(dòng)子區(qū)域是否存在直接作用；
　?。?）構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥NOD-SCID鼠模型，運(yùn)用β-catenin siRNA阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，觀察雌激素對(duì)小鼠模型異位內(nèi)膜EMT分子標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin，核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表

8、達(dá)以及基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinases9，MMP9）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）內(nèi)異癥患者EC中E-cadherin的表達(dá)較EU和NOR明顯降低，而EU和NOR中E-cadherin的表達(dá)無(wú)顯著差異；EC中N-cadherin、Vimentin的表達(dá)較EU和NOR明顯增高，而EU和N

9、OR中N-cadherin、Vimentin的表達(dá)無(wú)顯著差異；EC中β-catenin和Snail的表達(dá)較在EU和NOR明顯增高，而EU和NOR中β-catenin和Snail的表達(dá)無(wú)顯著差異，β-catenin和Snail的表達(dá)存在正相關(guān)性；
　?。?）QRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示內(nèi)異癥患者EC中E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)較EU和NOR明顯降低，而N-cadherin、Vimentin

10、 mRNA和蛋白的表達(dá)較EU和NOR明顯增高；EC中β-catenin和Snail mRNA和蛋白的表達(dá)較EU和NOR明顯增高；
　　（3）以不同濃度17β-雌二醇（17β-E2）作用人子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞（EECs）48h；普通光學(xué)顯微鏡下觀察，17β-E2作用后，細(xì)胞接近紡錘狀，纖維樣的形態(tài)，細(xì)胞間連接由緊密變得分散；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示17β-E2作用后，EECs中E-cadherin表達(dá)下降；qRT-PCR和Western

11、blotting結(jié)果顯示雌激素體外能明顯促進(jìn)EECs中N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，抑制E-cadherin的表達(dá)；Transwell表明17β-E2增強(qiáng)EECs的侵襲與遷移能力；
　?。?）雌激素能明顯增加EECs中去磷酸化β-catenin的表達(dá)；免疫熒光結(jié)果表明雌激素能增加β-catenin的入核；
　?。?）高分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞，即Ishikawa細(xì)胞代替EECs。以不同濃度

12、（10-6、10-8 mol/L）17β-雌二醇作用Ishikawa細(xì)胞48h，qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示雌激素體外能明顯促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，抑制E-cadherin的表達(dá)；
　?。?）siRNA靶向沉默Ishikawa細(xì)胞β-catenin基因以阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，10-6 mol/L17β-雌二醇作用48

13、h，Western blotting結(jié)果顯示雌激素不能夠誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，即 E-cadherin表達(dá)沒(méi)有下降，N-cadherin和 Snail的表達(dá)沒(méi)有上升；Transwell表明Ishikawa細(xì)胞的侵襲與遷移能力明顯降低；
　　（7）雙熒光素酶和染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示β-catenin能與TCF3結(jié)合，作用于Snail啟動(dòng)子上游，正向調(diào)控Snail基因的表達(dá)，而雌激素能增強(qiáng)這一作用；
　?。?）術(shù)后10天，Sc

14、rambled siRNA+E2、β-catenin siRNA+E2和空白組的模型鼠異位病灶發(fā)生率分別為：75％、25%和0；術(shù)后21天，Scrambled siRNA+E2、β-catenin siRNA+E2和空白組的模型鼠異位病灶發(fā)生率分別為：64%、0和0；雌激素能夠增加異位病灶的種植率，而抑制β-catenin的表達(dá)后，種植的概率明顯降低；Western blotting結(jié)果顯示：術(shù)后10天，陰性 siRNA組 E-cadh

15、erin的表達(dá)低于 siRNA干擾組和種植前組；N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)高于siRNA干擾組和種植前組；術(shù)后21天，陰性siRNA組E-cadherin的表達(dá)低于種植前組；N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)明顯高于種植前組；IHC結(jié)果顯示：術(shù)后10天，VEGF和MMP9表達(dá)高于 siRNA干擾組和種植前組，而后兩者之間無(wú)顯著差異；術(shù)后21天，VEGF和MMP9