加味三棱丸對子宮內(nèi)膜異位癥雌激素生成的影響及機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，雌激素的合成代謝在內(nèi)異癥疾病的發(fā)生、發(fā)展中占有重要的地位。既往研究提示，加味三棱丸有效成分(以下簡稱SLW)具有良好的抗子宮內(nèi)膜異位癥作用。因此，以“EMS是雌激素依賴性疾病”為切入點(diǎn)，探討SLW源頭治療內(nèi)異癥的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，可為其早日成為新的內(nèi)異癥治療藥物提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。 目的:觀察SLW對內(nèi)異癥在位內(nèi)膜雌二醇生成水平的影響，及其對參與雌二醇生成過程中惡性正反饋循環(huán)的關(guān)鍵酶及轉(zhuǎn)錄因子的影響

2、；觀察SLW對大鼠異位子宮內(nèi)膜的發(fā)展、雌二醇生成、粘附及抗凋亡能力的影響，并進(jìn)一步探討SLW抑制內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞中雌二醇的生成在其抗子宮內(nèi)膜異位癥中的關(guān)鍵作用機(jī)制。方法 1.培養(yǎng)內(nèi)異癥和非內(nèi)異位癥在位內(nèi)膜(Eu and En)細(xì)胞，分為非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞組、內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞組、SLW 170μg/ml組、17μg/ml組、1.7μg/ml組及0.1mg/kg阿那曲唑組。采用WST-8法檢測SLW對Eu和En細(xì)胞增殖情況的影響，RT-P

3、CR法和western blot檢測En細(xì)胞及SLW處理后的Eu細(xì)胞中細(xì)胞色素P450芳香化酶(P450 arom)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)，類固醇類生成因子-1(SF-1)、小雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子(COUP-TF)mRNA及其蛋白的表達(dá)，17-β-羥甾類脫氫酶1，2(17-β-HSD 1，2)mRNA的表達(dá)情況；細(xì)胞免疫熒光法觀察En細(xì)胞及SLW處理后的Eu細(xì)胞中SF-1和COUP-TF蛋白的表達(dá)，電化學(xué)發(fā)光免疫法和放射免

4、疫法分別檢測SLW對Eu細(xì)胞培養(yǎng)液上清中雌二醇(E2)和前列腺素E2(PGE2)水平的影響。 2.選擇動情期大鼠行子宮內(nèi)膜自體移植術(shù)，建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥疾病模型，取移植物積液高度≥2mm，病理學(xué)檢查有子宮內(nèi)膜組織生長的成功模型動物，分為SLW 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組、0.1mg/kg阿那曲唑組、模型對照組，同時設(shè)立正常對照組。用藥前經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，除正常對照組外，各組異位內(nèi)膜體積間無顯

5、著性差異。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)28天。檢測異位內(nèi)膜體積，常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)法和western blot檢測異位組織中P450 arom和COX-2蛋白的表達(dá)；電化學(xué)發(fā)光免疫法和放射免疫法分別觀察SLW對異位內(nèi)膜組織中E2和PGE2水平的影響；免疫組織化學(xué)法和TUNEL法分別檢測SLW對大鼠異位子宮內(nèi)膜中細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。 3.首先將內(nèi)膜細(xì)胞分為非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞對照組、內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞對照組

6、和SLW 17μg/ml組，采用結(jié)晶紫染色法檢測內(nèi)膜細(xì)胞的粘附能力，明膠酶譜法分析內(nèi)膜細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2,9(MMP-2,9)及其酶原的活性，細(xì)胞免疫熒光法觀察組織型金屬蛋白酶抑制劑1，2(TIMP-1，2)蛋白的表達(dá)，ELISA法檢測內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量，流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法分別檢測內(nèi)膜細(xì)胞早期和晚期凋亡率。同時選取SLW的各測定指標(biāo)最佳作用時間點(diǎn)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測時間點(diǎn)。隨后，將SLW 1

7、7μg/ml與終濃度為1.34pg/ml～6.36pg/ml的雌二醇進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)，并同時設(shè)計(jì)0.1μg/ml阿那曲唑組和終濃度為1.34pg/ml～6.36pg/ml的雌二醇組作為正反對照，在各檢測時間點(diǎn)上按照上述方法對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測。 結(jié)果 1.WST-8法結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的Eu細(xì)胞在各時相點(diǎn)的增殖速度，明顯高于En細(xì)胞(P＜0.05)，但SLW對Eu細(xì)胞的增殖能力沒有顯著的影響；SLW 170μg/ml和17μg

8、/ml組在作用48h、72h和96h時，分泌雌二醇的水平較Eu細(xì)胞對照組明顯降低，差異顯著(P＜0.05)。而SLW1.7μg/ml組僅在96h時顯著降低內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞分泌雌二醇水平，其余各時間點(diǎn)與Eu細(xì)胞對照組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。westernblot和RT-PCR結(jié)果顯示，給予SLW 170μg/ml、17μg/ml和1.7μg/ml 48h后的Eu細(xì)胞，P450 arom、COX-2、SF-1蛋白和mRNA表達(dá)

9、較Eu細(xì)胞對照組明顯降低，而COUP-TF蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也顯示，SLW 170μg/ml、17μg/ml組SF-1陽性細(xì)胞累積光密度值與Eu細(xì)胞對照組比較顯著降低，而COUP-TF陽性細(xì)胞累積光密度值顯著升高(P＜0.05)，與western blot和RT-PCR。半定量分析結(jié)果一致。同時，放射免疫法結(jié)果顯示，SLW 170μg/ml、17μg/ml和1.7μg/ml組細(xì)胞上清中PGE2的

10、濃度，明顯低于Eu細(xì)胞對照組(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果同時顯示，經(jīng)SLW處理后， Eu細(xì)胞中HSD-1 mRNA表達(dá)顯著減少，而HSD-2 mRNA表達(dá)明顯升高，與Eu細(xì)胞對照組比較差異顯著(P＜0.05)。 2.造模28天后，腹壁移植物體積增大，出現(xiàn)液體積聚，呈隆起透明的小囊狀，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成。以抑制物積液高度＞2mm，病理學(xué)檢查有子宮內(nèi)膜組織生長為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，42只大鼠中40只符合上述標(biāo)準(zhǔn)，造模

11、成功率為95.24％。SLW 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組的移植物體積與模型對照組相比明顯減小，差異顯著(P＜0.05)。艇染色光鏡下觀察模型對照組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈高柱狀或矮柱狀，排列在囊泡內(nèi)腔面，細(xì)胞間連接較緊密，細(xì)胞核大，呈橢圓形，位于基底部，胞漿豐富，內(nèi)膜間質(zhì)豐富，其中有個別部位上皮層內(nèi)陷形成假腺體；SLW 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組和0.1mg/kg阿

12、那曲唑組的內(nèi)膜腺上皮層明顯變薄，細(xì)胞呈矮柱狀甚至扁平狀，松散排列。免疫組織化學(xué)和western blot結(jié)果顯示，SLw 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組異位內(nèi)膜組織中P450 arom蛋白的表達(dá)值與模型對照組比較，顯著降低(P＜0.05)；SLW 1.02mg/kg組可以顯著降低模型大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，SLW 0.34mg/kg組和0.11mg/kg組雖有一定的降低趨

13、勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。同時，電化學(xué)發(fā)光免疫法和放射免疫法結(jié)果也顯示，SLW1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組異位內(nèi)膜組織中E2和PGE2的濃度，也明顯低于模型對照組(P＜0.05)。 3.將SLW 17μg/ml與Eu細(xì)胞共同孵育24h后，ELISA法檢測結(jié)果顯示，Eu細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF的含量顯著高于En細(xì)胞組(P＜0.05)；結(jié)晶紫染色法、明膠酶譜法和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果分別顯示

14、，48h后Eu細(xì)胞的粘附百分?jǐn)?shù)，MMP-2,9及其酶原的活性顯著高于En細(xì)胞，而TIMP-1，2蛋白的表達(dá)明顯低于En細(xì)胞組(P＜0.05)；流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法結(jié)果分別顯示，72h后的Eu細(xì)胞早期凋亡百分?jǐn)?shù)顯著低于En細(xì)胞組，96h后Eu細(xì)胞晚期凋亡指數(shù)也顯著低于En細(xì)胞組(P＜0.05)；同時，SLW 17μg/ml可同時降低Eu細(xì)胞分泌的VEGF含量、細(xì)胞粘附百分?jǐn)?shù)、MMP-2,9及其酶原的活性，上調(diào)TIMP-1，2蛋白的表達(dá)

15、，增加Eu細(xì)胞早期和晚期凋亡數(shù)目，與Eu細(xì)胞對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。當(dāng)SLW 17μg/ml與雌二醇1.34pg/ml～6.36pg/ml聯(lián)合給予時，Eu細(xì)胞被SLW改善的惡性生物學(xué)行為被反向添加的雌二醇部分或完全恢復(fù)。其中，Eu細(xì)胞的粘附百分率、MMP-2和pro-MMP-9活力、TIMP-1，2蛋白的表達(dá)以及Eu細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF的含量與與Eu細(xì)胞對照組比較，已無顯著性差異(P＞0.05)。單加雌二醇可進(jìn)一步加強(qiáng)

16、Eu細(xì)胞的粘附、侵襲、促血管生成及抗凋亡能力，而特異性的芳香化酶抑制劑阿那曲唑0.01μg/ml的作用恰與雌二醇相反。結(jié)論1.SLW體外可抑制內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞雌二醇的生成，這種抑制作用非依賴于抑制Eu細(xì)胞的增殖，而與抑制Eu細(xì)胞SF-1表達(dá)，促進(jìn)COUP-TF表達(dá)，特異性地抑制Eu細(xì)胞中P450 arom的表達(dá)，進(jìn)而降低P450 arom對COX-2的激活作用，并降低Eu細(xì)胞分泌PGE2的水平，從而阻斷內(nèi)異癥內(nèi)膜局部雌激素合成的正反饋

17、機(jī)制密切有關(guān)。此外，SLw體外抑制Eu細(xì)胞HSD-1 mRNA表達(dá)、促進(jìn)HSD-2 mRNA表達(dá)的作用可能也是其降低Eu細(xì)胞雌二醇生成機(jī)制之一。 4.Eu細(xì)胞在體外與En細(xì)胞比較，粘附腹膜、侵襲腹膜基底膜、促血管生成及抗自身凋亡的能力更強(qiáng)，Eu細(xì)胞的上述特質(zhì)受其局部雌二醇濃度的影響。SLW可抑制Eu細(xì)胞粘附、侵襲、促血管生成，促進(jìn)Eu細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與SLW抑制Eu細(xì)胞與Ⅰ型膠原的特異性粘附，降低MMP-2,9活力，提高TIM