內異消對子宮內膜異位癥大鼠血管生成與雌激素的影響研究.pdf

1、子宮內膜異位癥(endometriosis，以下簡稱內異癥)是育齡婦女最常見的疾病，在一般人群中的發(fā)病率為10～15％[1]。內異癥的發(fā)病機制尚不明確[2]，目前主要的治療方式是采用手術移除異位病灶和雌激素治療，但這些治療通常會有副作用大且易復發(fā)的缺點。內異消緩釋膠囊是本課題組自行研制的抗子宮內膜異位癥的中藥新藥，由川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素組成，其處方與制備工藝已經申報國家技術發(fā)明號利。
　　 目的：
　　 本實驗主要

2、研究內異消對大鼠子宮內膜異位癥模型血管生成與雌激素的影響及相關機制，為將內異消研制成為治療子宮內膜異位癥的中藥新藥提供試驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.造模及模型成功判斷標準
　　 采用子宮內膜自體移植法建立大鼠子宮內膜異位癥模型，以移植物的體積大小、形態(tài)及病理檢查作為模型成功的依據(jù)。以同時符合以下3條標準者為成功模型：①移植物體積增大，被結締組織或大網膜覆蓋并有血管形成，呈隆起透亮的小囊狀，出現(xiàn)液體積聚，且積

3、液高度≥2 mm；②游標卡尺測量移植物的體積大小，異位組織體積=0.52×長×寬×高[4]，移植物體積≥8 mm3；③切取移植物送檢，證實移植物中有子宮內膜上皮細胞、腺體及間質的生長。
　　 2.分組及給藥
　　 除正常對照組以外，將造模成功的SD大鼠隨機分為模型對照組、孕三烯酮0.5 mg·kg-1·d-1組、內異消0.045 g·kg-1·d-1組，0.09 g·kg-1·d-1組，0.18 g·kg-1·d-1組，

4、每組各10只，于模型成功后第4 d開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4wk。
　　 3.內異消抑制子宮內膜異位癥大鼠血管生成作用觀察
　　 給藥4 wk后，擇動情期處死大鼠，觀察移植物的生長情況，取在位和異位子宮內膜，進行HE染色病理檢查觀察。免疫組化和 Western Blot方法檢測異位內膜組織中微血管密度(MVD)、血管內皮生長因子(VEGF)和內皮抑素(endostatin)蛋白的表達，放射免疫分析法(RIA)檢測大鼠

5、血清和異位內膜組織中前列腺素E2(PGE2)的含量。
　　 4.內異消對子宮內膜異位癥大鼠雌激素影響的研究
　　 參照前面所述方法建立大鼠子宮內膜異位癥模型以及進行分組，每組各16只，于模型成功后第4 d開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 wk。分別于給藥第4 wk末、10 wk末各處死大鼠8只，取大鼠下丘腦、垂體、卵巢、血清、在位和異位子宮內膜。免疫組化檢測下丘腦中促性腺激素釋放激素(GnRH)，垂體中促卵泡激素(FSH

6、)和黃體生成激素(LH)，卵巢中雌激素受體(ER)的表達，Western Blot檢測異位內膜組織中ER、熱休克蛋白90(HSP90)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達，化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)分別檢測大鼠血清中雌二醇(E2)和孕酮(P)的含量。
　　 結果：
　　 1.造模結果
　　 造模4 wk后，擇動情期開腹觀察移植物生長情況，并用游標卡尺測量移植物大小。結果顯示，肉眼觀

7、察可見移植物被脂肪組織覆蓋并有血管生成，呈隆起透亮或黑色的小囊狀，出現(xiàn)液體積聚，體積增大，造模成功率為90.91％；HE染色結果顯示模型組大鼠異位內膜組織腺體上皮細胞呈高柱狀，排列在囊泡內腔面，細胞核大呈多層細胞排列，而正常對照組子宮內膜細胞呈松散排列，上皮細胞薄。
　　 2.內異消抑制子宮內膜異位癥大鼠血管生成作用
　　 連續(xù)給藥4 wk后，比較給藥前后移植物體積大小的變化，結果顯示內異消3個劑量組給藥后移植物體積比給

8、藥前明顯減小(P<0.01)，均能顯著抑制異位內膜組織體積的增生；HE染色結果顯示內異消組異位內膜腺上皮細胞層明顯變薄，細胞呈矮柱狀甚至扁平狀，單層細胞松散排列。
　　 免疫組化和Western Blot結果顯示模型組異位內膜組織中MVD和VEGF蛋白的表達顯著高于正常對照組(P<0.01)，內異消0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低內異癥大鼠MVD和VEGF蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)；

9、>　　 模型組異位內膜組織中endostatin蛋白的表達顯著低于正常對照組(P<0.01)，內異消0.18 g·kg-1能極顯著升高內異癥大鼠endostatin蛋白的表達(P<0.01)；
　　 RIA結果顯示模型組大鼠血清和異位內膜組織中PGE2的含量明顯高于正常對照組(P<0.01)，內異消0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低內異癥大鼠血清和異位內膜組織中PGE2的含量(P<0.05，P<0.01

10、)。
　　 3.內異消對子宮內膜異位癥大鼠雌激素的影響
　　 連續(xù)給藥4 wk后，免疫組化結果顯示模型組大鼠下丘腦中GnRH、垂體中FSH和LH、卵巢中 ER的表達極顯著高于正常對照組(P<0.01)；化學發(fā)光法結果顯示模型組大鼠血清中E2的含量顯著高于正常對照組(P<0.01)，內異消0.045g·kg-1、0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1能顯著降低大鼠血清中E2的含量(P<0.05，P<0.01)。

11、r>　　 連續(xù)給藥10 wk后，免疫組化結果顯示模型組大鼠下丘腦中GnRH、垂體中FSH和LH、卵巢中ER的表達極顯著高于正常對照組(P<0.01)，內異消0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低下丘腦中GnRH的表達、垂體中FSH和LH的表達、卵巢中ER的表達(P<0.05，P<0.01)；
　　 酶聯(lián)免疫法結果顯示模型組大鼠血清中P的含量極顯著低于正常對照組(P<0.01)，內異消0.09 g·kg-1、

12、0.18 g·kg-1均能顯著增高大鼠血清中P的含量(P<0.05，P<0.01)；
　　 免疫組化和Western Blot結果顯示模型組大鼠異位內膜組織中ER，HSP90和COX-2的表達極顯著高于正常對照組(P<0.01)，內異消0.045 g·kg-1、0.09 g·kg-1、0.18 g·kg-1均能顯著降低ER和HSP90蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)，內異消0.09g·kg-1、0.18 g·kg-1能顯

13、著降低COX-2蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.內異消具有抗子宮內膜異位癥大鼠異位組織血管生成作用，其作用機制與抑制VEGF蛋白表達和促進endostatin蛋白的表達有關。
　　 2.內異消能夠抑制子宮內膜異位癥大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸中與激素分泌相關的蛋白的表達，顯著降低子宮內膜異位癥大鼠血清中E2的含量，顯著升高P的含量，在異位病灶處抑制雌激素的表達，從而達到降低雌激素生