雌激素調(diào)控MAPK-CREB信號(hào)通路致子宮內(nèi)膜異位癥疼痛的分子機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(以下簡(jiǎn)稱為內(nèi)異癥)是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康的婦科常見疾病。雖然其發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，但其病因及發(fā)病機(jī)制至今仍然不清。疼痛是該病的特征性癥狀，但內(nèi)異癥疼痛的臨床治療包括藥物和手術(shù)治療目前存在差，副作用大，費(fèi)用高等嚴(yán)重問題。這嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，影響其家庭生活，可導(dǎo)致相應(yīng)的社會(huì)問題。就其根本原因是由于本癥疼痛的發(fā)生機(jī)制至今仍然未明，因此，只有闡明內(nèi)異癥疼痛的發(fā)生機(jī)制，才能根本解決異位癥的疼痛問題。
　　 近年研

2、究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥病灶中出現(xiàn)與雌激素相關(guān)的神經(jīng)纖維分布，這些病灶中的神經(jīng)纖維主要為轉(zhuǎn)導(dǎo)至脊髓背根節(jié)(DRG)神經(jīng)元的C和Aδ初級(jí)感覺神經(jīng)元，而其交感神經(jīng)纖維卻減少，導(dǎo)致病灶中神經(jīng)纖維分布失行。研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素能激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，內(nèi)異癥病灶中存在MAPK的高表達(dá)，給予鞘內(nèi)注射MAPK抑制劑后可使內(nèi)異癥病灶縮小、神經(jīng)纖維分布以及疼痛消失。由于內(nèi)異癥是一種雌激素依賴性疾病，內(nèi)異癥的疼痛也是一種內(nèi)臟牽涉痛或病理性疼痛，M

3、APK信號(hào)通路參與病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制已被公認(rèn)，因此，我們認(rèn)為雌激素也調(diào)控MAPK信號(hào)通路參與內(nèi)異癥疼痛的發(fā)病機(jī)制。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制中，雌激素主要是通過與神經(jīng)細(xì)胞膜上的雌激素受體(ER)結(jié)合后，然后激活ER/代謝型谷氨酸受體(mGluR)連接信號(hào)轉(zhuǎn)遞信使信號(hào)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括磷脂酶C(PLC)途徑和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，促使環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CRE

4、B)結(jié)合cAMP反應(yīng)元件而激活轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致下游靶基因的轉(zhuǎn)錄增加或減少，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)纖維突觸的可塑性變化以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，最后參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制。而CREB是一種依賴于MAPK信號(hào)通路的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，CREB磷酸化可直接導(dǎo)致靶基因合成功能蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。顯然，雌激素也調(diào)控MAPK/CREB信號(hào)通路參與內(nèi)異癥疼痛的發(fā)生機(jī)制。
　　 基于上述的設(shè)想我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究，首先以不同雌激素水平建立不同內(nèi)異癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，比較不

5、同雌激素模型的病灶大小和疼痛嚴(yán)重程度，以及同一模型不同雌激素水平之病灶大小和疼痛的差異，評(píng)價(jià)雌激素水平與內(nèi)異癥病灶及疼痛的關(guān)系；然后在不同模型中測(cè)定脊髓DRG中MAPK/CREB信號(hào)通路蛋白和基因表達(dá)水平，并在模型脊髓鞘內(nèi)給予各種注射MAPK/CREB信號(hào)通路阻斷劑干預(yù)，分析比較不同雌激素水平對(duì)MAPK/CREB信號(hào)通路蛋白和基因表達(dá)的影響，以及不同阻斷劑干預(yù)對(duì)MAPK/CREB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響，探討雌激素調(diào)控MAPK/CREB信

6、號(hào)通路的作用；最后在離體DRG細(xì)胞培養(yǎng)中以驗(yàn)證比較與在體的差異。以探索篩檢內(nèi)異癥疼痛神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，為內(nèi)異癥疼痛提供更有效的治療新靶。
　　 第一部分：雌激素在內(nèi)異癥疼痛及病灶發(fā)生與發(fā)展中的作用
　　 目的：
　　 了解雌激素與內(nèi)異癥疼痛和病灶大小的關(guān)系
　　 方法：
　　 選擇健康雌性未孕SD大鼠，按Berkley方法建立內(nèi)異癥SD大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將模型按下列進(jìn)行分組：
　　

7、 1.不同模型四組：造模同時(shí)不切除雙側(cè)卵巢為卵巢未切除組(EEDO組)，切除雙側(cè)卵巢為卵巢切除組(ENDO+OVX組)，切除雙側(cè)卵巢后給予每天肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇(0.1ml/kg)為雌激素應(yīng)用組(ENDO+OVX+E2組)，單純進(jìn)行手術(shù)而不做造模稱為假手術(shù)組(Control組)。
　　 2.同一模型四組：雌激素應(yīng)用組(模型組)，1倍劑量組(1E組)、2倍劑量組(2E組)、4倍劑量組(4E組)4組。
　　 造模后6天開腹

8、觀察病灶大小并測(cè)量其體積[V=1/2a×b2(a為最大橫徑，b為與之垂直的縱徑)]，應(yīng)用甩尾法測(cè)量熱痛覺閾值，應(yīng)用放免法測(cè)定血清雌激素水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.內(nèi)異癥SD大鼠模型均可見內(nèi)異癥病灶，其造模成功率達(dá)100％。
　　 2.模型病灶大小與血清雌激素水平顯著正相關(guān)(P<0.05)。
　　 3.模型熱痛覺閾值與血清雌激素水平顯著正相關(guān)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本

9、實(shí)驗(yàn)內(nèi)異癥造模成功率達(dá)100％。
　　 2.雌激素水平與內(nèi)異癥模型病灶大小及疼痛有關(guān)。
　　 第二部分：MAPK/CREB信號(hào)通路介導(dǎo)雌激素致內(nèi)異癥疼痛的作用
　　 目的：
　　 分析比較不同雌激素和不同抑制劑干預(yù)后對(duì)MAPK/CREB信號(hào)通路蛋白及基因表達(dá)的影響，闡明雌激素調(diào)控MAPK/CREB信號(hào)通路的作用。
　　 方法：
　　 按第一部分的方法建立內(nèi)異癥SD大鼠模型，在造模后6天、1

10、2天及24天后取DRG組織，應(yīng)用PCR方法檢測(cè)DRG組織中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF基因的基因表達(dá)，應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)DRG組織中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF蛋白及蛋白磷酸化水平。在造模后24天在鞘內(nèi)分別注射MEK、ERK、mGlR5、mGlR1、ER、PKC、PLC抑制劑0.2ml(5μmol/ml)后兩小時(shí)處死取DRG組織，按上述方法測(cè)定MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF蛋白及蛋

11、白磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.雌激素對(duì)DRG組織中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF的蛋白和基因表達(dá)水平的影響
　　 MAPK、CREB、SP及BDNF基因表達(dá)水平均隨著雌激素濃度增加而增加，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，則出現(xiàn)下降趨勢(shì)。低濃度雌激素促進(jìn)MAPK、CREB、NGF及BDNF的蛋白表達(dá)以及MAPK蛋白磷酸化的表達(dá)水平，然而高劑量雌激素反而抑制MAPK、CREB、NGF及BDNF的蛋白表達(dá)以及MA

12、PK蛋白磷酸化的表達(dá)水平。
　　 2.各種抑制劑干預(yù)對(duì)MAPK、CREB、NGF及BDNF的蛋白表達(dá)水平的影響
　　 經(jīng)各種抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)，ERK通過mGluR1途徑，CREB通過ERα/mGluR5/MEK1/2信號(hào)通路，NGF通過ERα/mGluR5/PKC/MEK1/2/CREB信號(hào)通路，而BDNF蛋白表達(dá)沒有影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.雌激素調(diào)節(jié)MAPK/CREB信號(hào)通路蛋白及基因表達(dá)水平。

13、
　　 2.MAPK/CREB信號(hào)通路可能介導(dǎo)雌激素致內(nèi)異癥疼痛的分子機(jī)制。
　　 第三部分：SD大鼠離體DRG細(xì)胞培養(yǎng)研究
　　 目的：
　　 通過比較分析離體與在體的差異，進(jìn)一步明確雌激素調(diào)控MAPK/CREB信號(hào)通路的作用。
　　 方法：
　　 取16天孕鼠的DRG神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng).當(dāng)DRG神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)成單層貼壁細(xì)胞后進(jìn)行分組干預(yù)實(shí)驗(yàn)，給予培養(yǎng)液中分別加入2uMMEK、5

14、0uMERK、20uMmGlR5、13uMmGlR1、10uMER、10uMPKC、5uMPLC抑制劑后，給藥后1h收集細(xì)胞，應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)DRG細(xì)胞中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF蛋白及蛋白磷酸化水平。同時(shí)給予1uM、10uM及100uM雌二醇不同濃度經(jīng)15min、30min、60min及120min后，收集細(xì)胞，應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)DRG細(xì)胞中MAPK蛋白磷酸化水平。
　　 結(jié)果

15、：
　　 1.各種抑制劑干預(yù)對(duì)MAPK、CREB、NGF及BDNF蛋白表達(dá)的影響
　　 經(jīng)各種抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)，ERK通過ERα/mGluR1/PLC/PKC途徑，CREB通過ERα/mGluR1/PKC信號(hào)通路，BDNF通過ERα/mGluR5/PKC/MEK1/2/CREB信號(hào)通路，而NGF蛋白表達(dá)沒有影響。
　　 2.雌激素干預(yù)對(duì)MAPK蛋白磷酸化水平的影響
　　 DRG細(xì)胞給予不同濃度雌激素處理后