子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型建立及生物學(xué)研究和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)理研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，異位癥)是由具有生長(zhǎng)功能的異位子宮內(nèi)膜所致，異位子宮內(nèi)膜可以侵犯全身任何部位，但多數(shù)位于盆腔內(nèi)。生育年齡婦女是異位癥高發(fā)人群，生育少、生育晚的女性發(fā)病明顯多于多生育者，所以，中國(guó)近年來異位癥發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。異位癥是良性病變，但具有類似惡性腫瘤的種植侵蝕及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，患者呈持續(xù)加重的盆腔粘連、疼痛、不孕，而其發(fā)病機(jī)制尚不明確，異位癥早期特異性診斷方法的缺乏、治療的不徹底性、異位癥帶來的不良后

2、果等都是患者及婦科醫(yī)生困惑問題。 異位子宮內(nèi)膜隨卵巢激素變化而發(fā)生周期性出血，導(dǎo)致周圍纖維組織增生和囊腫粘連形成是異位癥的基本病理變化。子宮內(nèi)膜腺體、子宮內(nèi)膜間質(zhì)等典型組織結(jié)構(gòu)因此隨病情發(fā)展而難以發(fā)現(xiàn)，典型的病理所見并非異位癥診斷金標(biāo)準(zhǔn)，而且多數(shù)學(xué)者接受的子宮內(nèi)膜種植學(xué)說說明生育年齡婦女隨月經(jīng)周期經(jīng)血逆流，不斷發(fā)生新的子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植，使異位病灶內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)展存在不同步現(xiàn)象，這種病理特點(diǎn)使異位癥分子水平研究結(jié)論差異較大、爭(zhēng)議較多。

3、異位癥動(dòng)物模型的建立成為許多學(xué)者解決這一問題的主要手段。裸鼠以其遺傳背景明確、穩(wěn)定，不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，可以保持移植病變固有形態(tài)和生物學(xué)特性等優(yōu)勢(shì)，被國(guó)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于異位癥動(dòng)物模型的建立，獲得成功。但國(guó)內(nèi)始終未見相關(guān)報(bào)道。 異位癥是與遺傳、免疫等多因素相關(guān)的多因子疾病，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了許多相關(guān)研究，但始終未發(fā)現(xiàn)異位癥特異性靶標(biāo)。而異位癥特異性靶標(biāo)的研究正是解決早期診斷異位癥的主要途徑。異位內(nèi)膜細(xì)胞粘附、新血管生成、侵襲生長(zhǎng)是異

4、位病灶發(fā)生的基礎(chǔ)，相關(guān)細(xì)胞因子的作用得到廣泛研究，獲得相對(duì)統(tǒng)一的研究結(jié)論，即CAMs、VEGF、MMP等細(xì)胞因子在異位癥的發(fā)生和/或發(fā)展中起上調(diào)作用，但這些細(xì)胞因子在異位癥中的作用與在惡性腫瘤中的作用相似，缺乏特異性。EG-VEGF是近年美國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)的特異性血管形成有絲分裂因子，它與VEGF功能相似，結(jié)構(gòu)卻不同，其特點(diǎn)是它特異性表達(dá)于甾體激素內(nèi)分泌器官，并可能在該類器官增殖病變的新血管生成中起重要作用。EG-VEGF在異位癥中的特異性作

5、用尚未見報(bào)道，但其高度組織特異性的特征將引起廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注。 芳香化酶是雌激素合成的限速酶，它不僅以內(nèi)分泌機(jī)制影響體循環(huán)中雌激素合成，而且以自分泌和旁分泌機(jī)制影響局部雌激素的合成。異位癥是雌激素依賴性疾病，異位癥根治術(shù)后仍然存在復(fù)發(fā)機(jī)率、個(gè)別異位癥患者絕經(jīng)后病變繼續(xù)發(fā)展等現(xiàn)象證明異位病灶可能存在局部雌激素作用，所以，芳香化酶在異位癥在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的表達(dá)及其在異位癥發(fā)病機(jī)理中的作用受到學(xué)者們關(guān)注。 該課題旨在研究異

6、位癥裸鼠模型的建立及相關(guān)生物學(xué)研究。并從分子水平研究EG-VEGF在異位癥發(fā)病機(jī)理中特異性作用。依據(jù)芳香化酶在雌激素合成中的關(guān)鍵作用，研究芳香化酶在異位癥的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中特異性表達(dá)，為探索異位癥早期診斷途徑提供新思路。 方法: 選擇異位癥患者和非異位癥患者各24例，手術(shù)切除子宮中獲取分泌晚期子宮內(nèi)膜，隨機(jī)種植于雌性裸鼠盆腹腔內(nèi)，雌激素支持，分別于5天、15天、30天處死裸鼠，觀察裸鼠異位病灶生長(zhǎng)情況，同時(shí)，種植大網(wǎng)

7、膜組織做對(duì)照觀察。另通過手術(shù)中獲取子宮內(nèi)膜異位囊腫壁30例(Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期各15例)及正常對(duì)照卵巢組織15例。通過光鏡及透視電鏡觀察異位病灶組織學(xué)變化。采用RT-PCR方法檢測(cè)：EG-VEGFmRNA在裸鼠異位病灶及人在位內(nèi)膜、在子宮內(nèi)膜異位囊腫壁及卵巢中的表達(dá)及相互關(guān)系；芳香化酶mRNA在裸鼠異位病灶及人在位內(nèi)膜中的表達(dá)；VEGF及MMP-9mNRA在裸鼠異位病灶及人在位內(nèi)膜的表達(dá)。采用原位雜交法檢測(cè)EG-VEGFmRNA在裸鼠異

8、位病灶及人在位內(nèi)膜中的表達(dá)部位及程度。免疫組化法檢測(cè)裸鼠異位病灶及人在位內(nèi)膜雌、孕激素受體表達(dá)及芳香化酶蛋白表達(dá)。 結(jié)果: 研究結(jié)果顯示，人子宮內(nèi)膜置入裸鼠盆腹腔后，全部種植生長(zhǎng)，以腹壁、膀胱旁脂肪為主要生長(zhǎng)部位。5天異位病灶即與裸鼠組織牢固粘附，新血管形成。15天病灶變硬，與裸鼠組織呈融合生長(zhǎng)，周圍粘連。30天病灶萎縮變小，局部粘連較重。光鏡下，腺細(xì)胞呈立方形或扁平狀，血供豐富，腺細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、炎細(xì)胞及裸鼠脂肪細(xì)胞等

9、混合存在。越晚期纖維化越重。電鏡下，5天腺細(xì)胞纖毛變短，細(xì)胞器清晰可見；15天腺細(xì)胞核膜皺縮，細(xì)胞器不完整；30天細(xì)胞器消失，染色質(zhì)聚集，但仍可見分泌顆粒。異位癥及非異位癥內(nèi)膜種植的異位病灶形態(tài)學(xué)及組織學(xué)均無差異。 異位癥與非異位癥在位內(nèi)膜比較，EG-VEGF、VEGF、MMP-9及芳香化酶mRNA相對(duì)表達(dá)含量無顯著差異(P＞0.05)，異位癥組在位內(nèi)膜芳香化酶mRNA陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于非異位癥組在位內(nèi)膜。與相應(yīng)在位內(nèi)膜比較，裸

10、鼠異位病灶EG-VEGF、VEGF、MMP-9及芳香化酶mRNA相對(duì)表達(dá)含量均明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，其中，EG-VEGFmRNA15天組表達(dá)最強(qiáng)，與30天組比較，P＜0.05；VEGF、MMP-9mRNA15天組與5天、30天組比較，均P＜0.05；芳香化酶mRNA5天、15天、30天各組表達(dá)無顯著差異，P＞0.05。在子宮內(nèi)膜異位囊腫中，Ⅰ～Ⅱ期組與Ⅲ～Ⅳ期組比較，EG-VEGF/VEGFmRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，P＜0.05。

11、 EG-VEGFmRNA雜交信號(hào)主要分布于腺體細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞胞漿中，裸鼠異位病灶中，5天、15天組以強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主，30天組及在位內(nèi)膜以弱陽(yáng)性表達(dá)為主。中、早期異位病灶(5天組+15天組)陽(yáng)性表達(dá)率高于晚期(30天組)異位病灶及在位內(nèi)膜，P＜0.05。在子宮內(nèi)膜異位囊腫中，早期陽(yáng)性表達(dá)率明顯強(qiáng)于晚期，P＜0.05，Ⅰ～Ⅱ期以強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主(10/13)，Ⅲ～Ⅳ期以弱陽(yáng)性表達(dá)為主(6/9)。 裸鼠異位病灶中，免疫組化法檢測(cè)雌、

12、孕激素受體(ER、PR)，5天、15天組陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于30天組，P＜0.05，以弱陽(yáng)性表達(dá)為主。異位癥組與非異位癥組異位病灶ER、PR表達(dá)無差異。異位癥組在位內(nèi)膜芳香化酶蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(91.67％)高于非異位癥組在位內(nèi)膜(70.83％)，P＜0.05。異位癥組裸鼠異位病灶芳香化酶陽(yáng)性表達(dá)率(91.67％)與在位內(nèi)膜比較，無顯著差異，P＞0.05；非異位癥組異位病灶芳香化酶蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(95.83％)與在位內(nèi)膜比較，差異顯著，P＜

13、0.05。 結(jié)論: 1.該研究結(jié)果表明，建立子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型，用于異位癥基礎(chǔ)及臨床研究，方法簡(jiǎn)便，其形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及生物學(xué)變化規(guī)律與人異位癥相似。異位癥早期、中期血管生成及侵襲能力強(qiáng)于晚期病變，晚期異位癥發(fā)展機(jī)制可能更復(fù)雜。異位癥及非異位癥在位內(nèi)膜種植的異位病灶，形態(tài)學(xué)及組織學(xué)變化無明顯差異。 2.EG-VEGF基因作為甾體激素內(nèi)分泌器官特異性血管形成有絲分裂因子，在雌激素靶組織—子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)中也表