硫鏈絲菌肽治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效觀察及機制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS，簡稱內(nèi)異癥）是子宮內(nèi)膜組織種植和生長在子宮腔以外的一種慢性、雌激素依賴性的疾病。作為最為常見的婦科疾病之一，內(nèi)異癥在育齡期女性中的發(fā)病率為10％～15％，以慢性盆腔痛、痛經(jīng)、不孕為主要癥狀。高達35％～50％的慢性盆腔痛和不孕患者診斷為內(nèi)異癥，發(fā)病率呈上升趨勢。大量的證據(jù)表明雌激素在異位病灶的建立和發(fā)展中起著重要的作用。然而，其發(fā)病機制尚不明確。
　　主要的學(xué)說和發(fā)病因素包括:(

2、1)異位種植學(xué)說，包括經(jīng)血逆流學(xué)說和淋巴和靜脈學(xué)說，經(jīng)血通過輸卵管進入盆腔，76％～90％的生育期女性中存在經(jīng)血逆流的情況，但其中只有很少一部分女性發(fā)生內(nèi)異癥。此學(xué)說不能解釋青春期、新生兒的內(nèi)異癥。(2)體腔上皮化生學(xué)說及誘導(dǎo)學(xué)說，假設(shè)內(nèi)異癥是由內(nèi)臟和盆腔腹膜的間皮細胞化生而來，卵巢激素和免疫因子可刺激體腔上皮分化而來的組織和未分化的腹腔組織向內(nèi)膜樣組織轉(zhuǎn)化。但由于青春期少女的雌激素水平是不高的，因此該學(xué)說只可解釋部分的青春期的內(nèi)異癥;

3、(3)苗勒氏管發(fā)育異常學(xué)說;(4)遺傳因素，此學(xué)說基于內(nèi)異癥有一定的家族聚集性，已發(fā)現(xiàn)異位組織中存在染色體異常和表觀遺傳修飾的異常;(5)氧化應(yīng)激和炎癥因素，脂蛋白的過氧化與內(nèi)異癥的病理有關(guān)，導(dǎo)致異位組織的DNA損傷。過量的活性氧也會消除抗氧化物，從而不能清除異位內(nèi)膜;異位組織產(chǎn)生大量的巨噬細胞、前列腺素、細胞因子和趨化因子等;(6)其他學(xué)說及因素，例如干細胞學(xué)說和異位內(nèi)膜細胞凋亡抑制等。本病病因復(fù)雜，以上學(xué)說均不能完全闡釋內(nèi)異癥的發(fā)病

4、機制。
　　內(nèi)異癥與癌癥之間的組織學(xué)聯(lián)系的假說最早在1925年被提出。Sampson基于在顯微鏡下觀察組織，提出了上皮性卵巢癌起源于內(nèi)異癥，并描述了診斷內(nèi)異癥相關(guān)的卵巢癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括(1)內(nèi)異癥鄰近腫瘤發(fā)生的部位的證據(jù);(2)排除其他來源的腫瘤轉(zhuǎn)移;(3)子宮內(nèi)膜上皮細胞及其周圍的特征性的腔上皮腺體樣的組織的存在。Scottet在1953年補充了第四條診斷標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤組織中，存在內(nèi)異癥的良性改變向惡性改變轉(zhuǎn)變的組織學(xué)證據(jù)。如今，

5、這四條標(biāo)準(zhǔn)仍然被用來定義內(nèi)異癥相關(guān)的惡性腫瘤(endometriosis-associated malignancy，EAM)。內(nèi)異癥是內(nèi)異癥相關(guān)的卵巢癌的癌前病變的一個有力的支持是，在異位的內(nèi)膜組織中發(fā)現(xiàn)了很多致癌基因與抑癌基因的突變。大量證據(jù)表明內(nèi)異癥與癌癥之間存在聯(lián)系，特別是透明細胞性卵巢癌。因此，異位內(nèi)膜中的腫瘤抑制因子和致癌因子表達的改變或許會導(dǎo)致異位組織的異常增殖。內(nèi)異癥被認(rèn)為是遺傳學(xué)的不穩(wěn)定，在內(nèi)異癥和卵巢癌中都能發(fā)現(xiàn)腫瘤

6、抑制因子的基因突變，如PTEN，p53，bcl，ARID1A和TP53。越來越多的證據(jù)表明異常的表觀遺傳修飾在內(nèi)異癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，如DNA甲基化異常、microRNA表達以及組蛋白修飾。另外，在組蛋白去乙酰化酶也存在異常的修飾。H3K27me3是研究較多的組蛋白化學(xué)修飾，可沉默基因轉(zhuǎn)錄及在干細胞分化和致癌中起一定的作用。Janice B及其團隊的實驗研究提出，在異位內(nèi)膜組織中存在著組蛋白3(H3)的甲基化水平升高，H3K4

7、(組蛋白3賴氨酸4位)、H4K9和H3K27高甲基化、類固醇生成因子-1(SF1)的啟動子乙?；?。內(nèi)異癥患者和對照組的分泌期子宮內(nèi)膜組蛋白3賴氨酸4位的三甲基化(H3K27me3)水平均升高。越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳修飾異常在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制的研究中扮演重要的角色。這些異常的表現(xiàn)包括DNA甲基化、microRNA表達和組蛋白修飾異常等。
　　目前，解釋內(nèi)異癥相關(guān)的惡性腫瘤起源于內(nèi)異癥的主要有兩大理論。學(xué)者們通過大量的

8、組織病理學(xué)研究后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥相關(guān)的卵巢癌(endometriosis-associated ovarian cancer，EAOC)可能來源于卵巢部位的不典型內(nèi)異癥。卵巢內(nèi)異癥的這種組織學(xué)異質(zhì)性表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜腺體伴隨著異質(zhì)性的細胞學(xué)或非典型的鞋釘細胞。La Grenade和Silverberg在1988年首先提出不典型的內(nèi)異癥與卵巢癌之間有著直接聯(lián)系。在5例卵巢癌患者（其中包括3例透明細胞癌和2例子宮內(nèi)膜樣癌）中，其卵巢部位均存在不典型

9、的內(nèi)異癥，其中4例的不典型內(nèi)異癥病灶鄰近所罹患的卵巢癌。此外，已被證明不典型的內(nèi)異癥患者發(fā)展為內(nèi)異癥相關(guān)的卵巢癌的風(fēng)險顯著高于單純的內(nèi)異癥患者。雖然很多流行病學(xué)分析支持不典型內(nèi)異癥可能是一種癌前病變，并且也可在80％的內(nèi)異癥相關(guān)的卵巢癌中檢測出不典型的內(nèi)異癥，但這個結(jié)論仍然沒有得到足夠多的證據(jù)。一些研究提出，內(nèi)異癥與內(nèi)異癥相關(guān)的卵巢癌所在的微環(huán)境有著相似的介質(zhì)和細胞因子。但內(nèi)異癥相關(guān)的惡性腫瘤由異位內(nèi)膜細胞向惡性轉(zhuǎn)化是否通過它們的中間狀

10、態(tài)——不典型內(nèi)異癥發(fā)展而來以及它們類似的微環(huán)境之間的聯(lián)系仍未被清楚闡明。
　　內(nèi)異癥是具有惡性生物學(xué)行為的良性疾病，它有與惡性腫瘤相似的惡性生物學(xué)行為，如增殖侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的能力，異位內(nèi)膜可以粘附、侵入和破壞所在部位及其周圍的組織。但內(nèi)異癥并不像腫瘤那樣引起代謝的變化最終導(dǎo)致死亡。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者的上皮性卵巢癌和透明細胞癌風(fēng)險增加。FOXM1在上皮性卵巢癌中表達豐富并與低生存率和耐藥性有關(guān)。如今的治療方式可分為癥狀性的和有生育

11、需要的治療，例如手術(shù)和常規(guī)的激素治療。所有的這些治療方式都是局限的，并且存在很多副反應(yīng)。然而，在這些治療中斷之后存在較高的復(fù)發(fā)率。
　　叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead Box M1，F(xiàn)OXM1)是在細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用的一種轉(zhuǎn)錄因子。作為在腫瘤形成的早期就被上調(diào)的蛋白，F(xiàn)OXM1已經(jīng)被證明在腫瘤的各個階段均起著重要作用。FOXM1在各種各樣的實體腫瘤和血液系統(tǒng)的腫瘤中都存在過表達，如肝細胞癌、急性髓性白血病、胰腺

12、癌和卵巢癌。Ras/MAPK(Ras，ERK)、AKT和p38信號通路是在腫瘤中經(jīng)常被激活的通路，而這些通路也可以調(diào)節(jié)FOXM1的表達。
　　噻唑類抗生素是轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的小分子抑制劑，包括絲裂霉素A和硫鏈絲菌肽，都在多種腫瘤的體內(nèi)外實驗中被證明有抗腫瘤活性。這些抑制劑可以抑制FOXM1的轉(zhuǎn)錄，有較高的特異性，而對其他的轉(zhuǎn)錄因子不會產(chǎn)生影響。硫鏈絲菌肽不僅是一個噻唑類抗生素，而且是一個蛋白酶體抑制劑，調(diào)節(jié)FOXM1的轉(zhuǎn)錄活性和

13、表達。它能通過不同的信號通路在很多的腫瘤細胞中產(chǎn)生抗腫瘤的活性。Maqbool等在甲狀腺乳頭狀癌小鼠體內(nèi)移植模型中發(fā)現(xiàn)，硫鏈絲菌肽通過抑制FOXM1、MMP2和MMP9的表達抑制腫瘤的發(fā)展，而在體外實驗中，硫鏈絲菌肽同時可以減少腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　目的：
　　在本研究中，我們研究FOXM1在內(nèi)異癥中的表達，探討雌激素在ERK/FOXM1/MMP9信號通路中的作用機制。最后，在內(nèi)異癥大鼠模型中使用硫鏈絲菌肽治療異位病灶

14、，以確定其下調(diào)FOXM1和MMP9的表達、促進凋亡和減小異位病灶的能力，評估其療效。
　　方法：
　　1、每天在固定的時間進行大鼠陰道涂片，確定動情周期。連續(xù)兩個動情周期正常的大鼠納入本實驗中。50只雌性Wistar大鼠通過自體皮下移植法建立內(nèi)異癥模型。
　　2、4周后，所有大鼠進行第二次開腹手術(shù)觀察異位病灶生長情況，用游標(biāo)卡尺測量移植物的長寬高(mm)，用公式V=0.52*長*寬*高，計算其體積。
　　3、將造

15、模成功的大鼠隨機分為去卵巢組和治療組，每組分別為20只與30只。去卵巢組大鼠經(jīng)手術(shù)去除卵巢后，進一步隨機分為雌激素組和對照組。術(shù)后觀察3天，不給于任何治療。雌激素組的大鼠皮下注射雌激素(10ug/0.1 ml/只/天），而對照組給予等劑量的芝麻油，每組皮下注射7天。治療組隨機分為150mg/kg硫鏈絲菌肽組、250mg/kg硫鏈絲菌肽組和對照組（等量生理鹽水），腹腔注射，兩天一次，共14天。
　　4、用藥結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺測量病灶

16、體積。組織學(xué)染色證實造模成功，免疫染色檢測FOXM1在異位病灶中的定位和表達情況。Real-time PCR檢測mRNA的水平。Western blot檢測各組ERK/FOXM1/MMP9信號通路相關(guān)蛋白和Bcl-2的表達。
　　結(jié)果：
　　1、組織病理學(xué)染色:第一次開腹手術(shù)28天后，組織病理學(xué)確認(rèn)造模成功。肉眼觀，所有造模組的內(nèi)膜組織均在腹壁發(fā)展為典型的異位內(nèi)膜病灶，半透明囊球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)含淡黃或清亮無色液體，病灶表面及周圍有

17、血管形成。組織學(xué)染色證實可見異位內(nèi)膜有與正常內(nèi)膜類似的子宮內(nèi)膜柱狀上皮細胞的腔樣結(jié)構(gòu)和與腺體。
　　2、FOXM1的免疫學(xué)染色:免疫熒光染色顯示FOXM1主要定位在子宮內(nèi)膜的柱狀上皮細胞和基質(zhì)細胞的細胞核和細胞質(zhì)。雌激素組與其相對應(yīng)的對照組相比，F(xiàn)OXM1表達顯著升高，且主要表達在細胞核。
　　3、FOXM1和MMP9的mRNA表達:熒光定量PCR結(jié)果顯示，雌激素組與對照組相比，F(xiàn)OXM1和MMP9基因表達升高(P＜0.05

18、)。
　　結(jié)論：
　　1、FOXM1在雌激素組的異位內(nèi)膜中表達豐富，特別是異位子宮內(nèi)膜柱狀上皮細胞的細胞核。
　　2、運用雌激素作用后，ERK/FOXM1/MMP9信號通路蛋白表達升高，表明該通路可能參與了內(nèi)異癥的發(fā)生和發(fā)展。
　　3、硫鏈絲菌肽可以減少內(nèi)異癥大鼠異位組織FOXM1和MMP9的表達，且呈劑量依賴性，由此推斷硫鏈絲菌肽有望成為治療內(nèi)異癥的藥物之一。
　　4、硫鏈絲菌肽下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2