雷公藤甲素對(duì)人乳腺癌干細(xì)胞干性的影響與初步機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是女性癌癥患者最常見的一種惡性腫瘤，為我國(guó)婦女常見好發(fā)腫瘤之一，發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，給婦女的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。一般來(lái)說(shuō)，治療乳腺癌有效方法是在發(fā)病早期腫瘤未擴(kuò)散之前進(jìn)行手術(shù)治療，切除患者乳房。但是，晚期患者無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，多采用化療，比如使用阿霉素、紫杉醇、順鉑以及聯(lián)合給藥等。然而，化療時(shí)很容易發(fā)生耐藥(Multi-drug Resisitance，MDR)，甚至是化療后腫瘤復(fù)發(fā)。因此，開發(fā)有效的臨床藥物進(jìn)行化療追在眉梢，可

2、以避免患者產(chǎn)生因手術(shù)帶來(lái)的心理陰影，提高其生活質(zhì)量。
　　國(guó)外很多學(xué)者研究表明，腫瘤組織細(xì)胞中存在一小群有自我更新能力，且可以無(wú)限增殖，具有多向分化潛能的細(xì)胞群，這一小群細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSCs)。CSCs是形成分化程度不同的腫瘤細(xì)胞以及腫瘤不斷擴(kuò)大的源頭，很可能是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根本原因?，F(xiàn)今越來(lái)越多的研究表明，乳腺癌干細(xì)胞(Breast Cancer Stem Cells，BCS

3、Cs)是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及治療抵抗的罪魁禍?zhǔn)?，而靶向腫瘤干細(xì)胞的藥物則可能減少腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及治療抵抗。
　　雷公藤甲素(Triptolide，Tpl.)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取出的一種活性物質(zhì)，是雷公藤發(fā)揮藥物活性的主要有效成分，在體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。其功效主要為祛風(fēng)除濕、消腫止痛。藥理研究也表明其還有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤等作用。雷公藤甲素廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮

4、膚病等多種自身免疫和炎性疾病。
　　一些學(xué)者研究成果表明雷公藤甲素可以通過(guò)抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性來(lái)起到抑制腫瘤的作用。比如，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性可被雷公藤甲素抑制。另外一些研究也發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可影響腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)及其干細(xì)胞特性，但研究較多集中在膠質(zhì)瘤上，而針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞研究未見報(bào)道。
　　本文通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)雷公藤甲素抗乳腺癌干細(xì)胞干性作用，并在前人文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步摸索其分子機(jī)制，為擴(kuò)展雷公藤甲

5、素的臨床應(yīng)用，以及今后進(jìn)一步尋找作用高效特異的靶向腫瘤干細(xì)胞的抑制劑奠定基礎(chǔ)。
　　一、雷同藤甲素抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7ADM耐藥
　　本實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)SRB法檢測(cè)雷公藤甲素、阿霉素及兩者聯(lián)合對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7ADM細(xì)胞毒作用，此細(xì)胞株為耐阿霉素細(xì)胞株。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素對(duì)其半數(shù)抑制濃度IC50值為102.48μM，而雷公藤甲素對(duì)其IC50值為0.15μM，兩者聯(lián)合作用時(shí)IC50值為6.58μM。說(shuō)明雷

6、公藤甲素可以明顯抑制MCF-7ADM細(xì)胞耐阿霉素作用，并且通過(guò)計(jì)算兩者聯(lián)合用藥時(shí)的聯(lián)合指數(shù)CI值發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合給藥具有協(xié)同作用。
　　二、雷公藤甲素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞干性的影響
　　本實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析雷公藤甲素對(duì)CD44+/CD24-/low乳腺癌干細(xì)胞、側(cè)群(Side Population，SP)細(xì)胞比例的影響，聯(lián)合克隆形成實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)考察雷公藤甲素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的干性影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素可

7、降低SP細(xì)胞及CD44+/CD24-low乳腺癌干細(xì)胞的比例，推斷其對(duì)干細(xì)胞殺傷作用強(qiáng)于非干細(xì)胞。而且，雷公藤甲素還可以明顯抑制軟瓊脂克隆形成、懸浮培養(yǎng)微球體的生長(zhǎng)以及劃痕愈合，說(shuō)明雷公藤甲素具有一定的靶向乳腺癌干細(xì)胞作用特點(diǎn)。
　　三、雷公藤甲素影響乳腺癌干細(xì)胞分子機(jī)制初步探討
　　本實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)初步檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)不同劑量下雷公藤甲素對(duì)與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的Wnt信號(hào)通路影響。

8、r>　　檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶5(β-1，4-galactosyltransferase5，B4GalT5)表達(dá)的影響。
　　并通過(guò)RNAi抑制B4GalT5的表達(dá)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcriptional-PCR，RT-PCR)及WB法檢測(cè)B4GalT5干擾效率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)B4GalT5被干擾后SP比例變化，CD44+/CD24-/low乳腺癌干細(xì)胞比例變化，以及對(duì)劃痕愈合及蛋白糖