雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量的初步研究.pdf

1、雷公藤甲素(又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯醇；或Triptolide，TP)，是中藥雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，雷公藤甲素(TP)在治療各種免疫性疾病、炎性疾病及癌癥方面起了很大作用。但其臨床不良反應的發(fā)生頻率高，主要發(fā)生在消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨髓和血液系統(tǒng)等。因此，改良雷公藤甲素單體劑型、研究新型給藥系統(tǒng)以降低其毒性具有十分重要的意義

2、。本文是將雷公藤甲素(簡稱TP)制備成為雷公藤甲素脂質(zhì)體(簡稱TP-LP)，以達到藥物緩釋的目的，為后續(xù)體內(nèi)增效減毒研究奠定基礎。
　　 本文分為三部分：
　　 第一部分：雷公藤甲素脂質(zhì)體的處方前研究。
　　 目的：建立雷公藤甲素脂質(zhì)體的含量測定方法、測定雷公藤甲素在PBS中的溶解度及篩選包封率的測定方法，為雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備處方篩選、工藝研究、質(zhì)量研究及體外分析奠定基礎。
　　 方法：采用紫外-可見

3、全波長掃描測定雷公藤甲素和空白脂質(zhì)體的最大吸收峰，確定檢測波長。采用紫外分光光度法測定雷公藤甲素的含量，建立標準曲線；用紫外分光光度法測定雷公藤甲素在PBS中的溶解度；采用凝膠過濾法、高速離心法、透析法及超濾離心法這四種方法測定TP-LP的包封率，考察方法回收率，并以包封率為指標，進行方法的可行性分析。
　　 結果：全波長掃描結果：空白脂質(zhì)體在202nm有最大吸收，雷公藤甲素在220nm有最大吸收，雷公藤甲素發(fā)生顯色反應后在54

4、0nm有最大吸收；繪制雷公藤甲素在0.1539μg/ml～12.467μg/ml濃度范圍和1.3852μg/ml～112μg/ml濃度范圍的標準曲線，濃度與吸光度的線性關系良好，回歸方程分別為：A=0.0128 C+0.0022(r=0.9984，n=5)和A=0.0097 C+0.02(r=0.998，n=5)；測定雷公藤甲素在pH7.0 PBS中溶解度約為21.55μg/ml；四種包封率測定方法對游離藥物回收率分別為：107.1％、

5、92.2％、107.8％、95.3％，對脂質(zhì)體回收率分別為較好、不好、較好、好；
　　 結論：對結果分析，雷公藤甲素在220nm處最大吸收與空白脂質(zhì)體于202nm處最大吸收峰相近，在含量測定中易導致干擾，最終確定540nm作為雷公藤甲素的檢測波長；PBS溶解度測定結果表明，雷公藤甲素在PBS中有微量溶解，對包封率測定方法的篩選提供了一定參考；經(jīng)可行性分析，相對于其他包封率測定方法，超濾離心法對游離藥物和脂質(zhì)體回收率好，因此確定采

6、用超濾離心法測定雷公藤甲素脂質(zhì)體的包封率。
　　 第二部分雷公藤甲素脂質(zhì)體制備方法篩選及制備工藝的研究。
　　 目的：以包封率為指標，篩選TP-LP的最佳制備方法；以脂質(zhì)體粒徑、穩(wěn)定性及包封率為指標優(yōu)化TP-LP的制備工藝。
　　 方法：分別采用薄膜分散法、機械勻漿法、乙醇注入法制備TP-LP，以包封率為衡量指標，采用超濾離心法分離脂質(zhì)體和游離藥物，測定包封率，篩選最佳制備方法；在空白脂質(zhì)體的制備工藝研究中，以空

7、白脂質(zhì)體粒徑和穩(wěn)定性為指標，對制備條件：磷脂與膽固醇比例、氯仿用量及超聲情況進行優(yōu)化；在TP-LP制備工藝研究中，以包封率為衡量指標，采用正交優(yōu)化方法優(yōu)化影響脂質(zhì)體包封率的三個制備條件：載藥溫度、藥物與磷脂質(zhì)量比(藥脂比)和載藥時間，采用超濾離心法分離脂質(zhì)體和游離藥物，紫外分光光度法測定游離藥物含量，計算TP-LP的包封率，篩選最佳制備工藝，并驗證最佳條件的準確性。
　　 結果：制備方法的篩選中，薄膜分散法、機械勻漿法、乙醇注入

8、法制備TP-LP的包封率分別為：12.7％、14％、13.6％；空白脂質(zhì)體制備工藝研究中，磷脂-膽固醇比為4∶1制備的脂質(zhì)體穩(wěn)定性好；超聲100w/5min處理的脂質(zhì)體粒徑分布好；用20ml氯仿制備的空白脂質(zhì)體粒徑分布較好。TP-LP制備工藝研究中，經(jīng)正交優(yōu)化實驗，制備條件：載藥溫度37℃、藥脂比1∶50、載藥時間60min所制備的雷公藤甲素脂質(zhì)體包封率最高；最后按最佳優(yōu)化條件同時制備三批TP-LP，測定其平均包封率為46.4％±0.0

9、295。
　　 結論：以包封率為指標，比較三種制備方法，機械勻漿法制備的TP-LP包封率較高，經(jīng)可行性分析，該方法簡單、可重復性好，因此確定機械勻漿法制備TP-LP；空白脂質(zhì)體單因素優(yōu)化結果顯示，制備最佳條件為：磷脂-膽固醇比例為4∶1，超聲100w/5min，氯仿用量20ml；TP-LP制備工藝正交優(yōu)化結果顯示，最佳制備條件為載藥溫度37℃、藥脂比1∶50、載藥時間60min。最佳條件重復驗證實驗結果驗證了正交優(yōu)化方法的準確性

10、。
　　 第三部分雷公藤甲素脂質(zhì)體的質(zhì)量研究及體外釋藥的初步研究。
　　 目的：對TP-LP進行質(zhì)量研究，為提高TP-LP穩(wěn)定性研究奠定基礎；進行TP-LP體外藥效初步研究，為其體內(nèi)藥效研究奠定基礎。
　　 方法：按最佳工藝制備TP-LP，用透射電鏡顯微觀察TP-LP形態(tài)，用動態(tài)光散射儀測定粒徑分布，用zeta電位分析儀測定TP-LP的zeta電位，從以上幾個指標對脂質(zhì)體進行質(zhì)量評價；分別加入不同凍干保護劑制備T

11、P-LP凍干粉，以脂質(zhì)體凍干粉的外觀、復水情況及復水后包封率為衡量指標，篩選最佳凍干保護劑；在體外釋藥實驗，采用透析法分別觀察TP和TP-LP的體外釋藥情況，采用紫外分光光度法測定不同時間點的累計釋藥量；體外藥效實驗，用TP、TP-LP處理經(jīng)PHA活化的人外周血單個核細胞，以MTT法為檢測方法，分別于24h、48h、72h測定TP、TP-LP抑制T淋巴細胞增殖的效果。
　　 結果：最佳優(yōu)化工藝制備的TP-LP，粒徑范圍在40nm

12、～250nm之間，平均粒徑為89.2nm。粒徑對稱分布，分散均勻，zeta電位平均值為-67.55mV，絕對值大于60mv；凍干粉的制備結果，5％蔗糖-甘露醇混合物(w∶w=1∶1)作為凍干保護劑所制備的凍干粉外觀良好，復水過程良好，無肉眼結晶。相對于其他保護劑制備的凍干粉，復水后的包封率下降程度小；TP-LP的體外釋藥實驗結果，44小時后，脂質(zhì)體中TP全部釋放，而游離TP在3h已完全釋放；體外藥效實驗結果顯示，24hTP-LP抑制T淋