核受體PXR調控MRP3表達在結腸癌耐藥中的作用研究.pdf

1、背景與目的：
　　 結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在我國有逐年上升趨勢。化療是結腸癌的重要治療手段之一。然而,耐藥形成是化療失敗并導致腫瘤復發(fā)和患者死亡的主要原因之一。多藥耐藥機制涉及藥物代謝酶和ABC轉運蛋白,但其詳細作用機制尚不清楚。
　　 孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)又名類固醇和外源性受體(steroid andxenobiotic receptor,SXR),屬核受體家

2、族重要成員之一,在保護機體免于內源性和外源性物質損傷方面有重要作用。PXR可廣泛調節(jié)藥物代謝及藥物轉運。與相應配體結合后被活化,與RXRa以異二聚體形式結合于靶基因的調控區(qū)域。PXR調控的靶基因包括:幾種細胞色素氧化酶如CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19和CYP286、脫氫酶、羧酸脂酶等;藥物Ⅱ相代謝還原酶如UDP-葡萄糖苷酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)和谷光苷肽S轉移酶(Glut

3、athione S-transferases,GSTs)等;(3)藥物Ⅲ相轉運體如MDR1、多藥耐藥相關蛋白家族、有機離子轉運肽2等。這些靶基因都涉及腫瘤多藥耐藥形成。PXR可能通過對其靶基因調控,介導藥物之間相互作用及個體對藥物的反應差異,改變腫瘤細胞內藥物代謝和轉運,影響腫瘤患者化療敏感性。由上可知,PXR涉及MDR機制眾多位點,這可能更符合體內多藥耐藥形成實質及腫瘤患者個體化治療需要。因此,PXR可能成為腫瘤治療和多藥耐藥研究的潛

4、在靶點。
　　 過表達ABC轉運體是腫瘤多藥耐藥的主要原因之一。MRP3是多藥耐藥相關蛋白家族(MRP,ABCC亞家族)的主要成員之一,屬ATP膜轉運蛋白,在氨基酸序列上與MRP1有58％同源性,編碼分子量為190kD的糖蛋白,表達于極性細胞基底側,主要分布于肝、十二指腸、結腸、腎上腺及胰腺等。MRP3作為一種有機陰離子轉運體,能轉運膽汁酸鹽、葡萄糖醛酸苷結合物以及某些化療藥物。有研究發(fā)現(xiàn)MRP3與白血病預后不良有關。在腫瘤細胞

5、中MRP3與鉑類藥物耐藥相關。兩個MRP3多態(tài)性位點已被鑒定可影響非小細胞肺癌患者鉑類藥物敏感性。MRP3基因多態(tài)性與結腸癌危險之間的關系已被研究,提示MRP3與結腸癌化療的遺傳藥理學有潛在的關聯(lián)。這些研究表明MRP3在腫瘤耐藥中的重要作用,也提示MRP3在以鉑類藥物為基礎的結腸癌化療中的可能作用。
　　 MRP3表達調控機制目前尚不清楚。分析MRP3啟動子區(qū)5’-端發(fā)現(xiàn)TATA盒較少,含多個SP1、AP-1、AP-2和LRH-

6、1的結合位點。大鼠近側Mrp3啟動子區(qū)SP1和LRH-1結合位點是Mrp3轉錄活性所必需的。最近有研究發(fā)現(xiàn)核受體涉及MRP3的轉錄調控,包括PPARa、VDR和RARα。PXR是否涉及其中尚無定論,但有研究發(fā)現(xiàn)PXR配體可誘導MRP3表達。
　　 本課題擬通過檢測包括PXR在內的代謝性核受體及耐藥相關基因在結腸癌組織中表達情況,初步探討PXR和其他代謝性核受體在結腸癌中意義,并進一步分析結腸癌組織中核受體PXR與耐藥相關基因的聯(lián)

7、系。通過活化或敲低PXR表達,研究其對結腸癌細胞增殖和化療敏感性影響,探討PXR調控MRP3表達及可能機制在結腸癌耐藥中的作用。
　　 方法
　　 1.收集結腸癌組織標本,采用RT-PCR和Western blot法,檢測結腸癌組織中核受體及耐藥相關基因表達情況。半定量分析PXR、MRP2和MRP3 mRNA表達,用配對樣本t檢驗比較癌與正常組織之間的差異,Pearson相關性檢驗分析PXR與MRP2、MRP3之間的關系

8、。
　　 2.RT-PCR和Western blot法檢測結腸癌細胞系核受體PXR表達情況,及10μM利福平處理LS174T細胞后PXR表達變化。MTT法觀察利福平作用后對LS174T細胞增殖及對化療藥物敏感性的影響。
　　 3.選用兩條針對PXR基因不同靶點的RNAi序列及隨機對照序列,構建真核表達質粒PXRi1＃、PXRi2＃以及陰性對照質粒PXRi control,轉染結腸癌LS174T細胞,用G418穩(wěn)定篩選出相

9、應細胞克隆。RT-PCR和Westernblot法檢測野生型LS174T細胞、PXRi control、PXRi1＃和PXRi2＃細胞PXR和MRP3表達情況,MTT法檢測PXR敲低后對結腸癌細胞增殖和化療敏感性的影響。
　　 4.RT-PCR和Western blot法檢測LS174T細胞經10μM利福平或5μM紫杉醇作用后SP1、PXR和MRP3表達變化。
　　 5.免疫熒光方法檢測5μM紫杉醇處理LS174T細胞后

10、膜蛋白MRP3和PXR表達變化及細胞定位。
　　 6.用PXR表達質粒、MRP3報告基因、pRL-SV40質粒共轉染LOVO細胞,分為四組:轉染Control組(共轉染相應空質粒)、DMSO組(共轉染PXR表達質粒+0.1％DMSO)、RIF組(共轉染PXR表達質粒+10μM RIF)和paclitaxel組(共轉染PXR表達質粒+5μM paclitaxel),然后用雙熒光素酶報告基因方法檢測MRP3報告基因螢火蟲熒光活性,以

11、pRL-SV40質粒海腎熒光活性為內參照。
　　 結果
　　 1.在結腸癌組織中,RARα、PXR、MRP2和MRP3 mRNA表達和蛋白表達明顯上調,VDR和PPARα mRNA表達也明顯上調,但FXR、LRH-1、SP1、ABCG2、MDR1和CYP3A4 mRNA表達變化不明顯。
　　 2.半定量分析顯示
　　 3.在結腸癌細胞株LS174T、LOVO、HT29和HCT116中,LS174T細胞高表

12、達PXR,低表達或不表達LRH-1。
　　 4.在10μM利福平作用下,LS174T細胞增殖速度明顯加快,第3天、第5天、第7天的490nm波長處吸光度值(OD)分別為:0.682±0.048、1.183±0.156、1.817±0.095;而0.1％DMSO處理對照組相應的OD值分別為:0.528±0.035、0.920±0.036、1.402±0.092。利福平組OD值均明顯高于相應DMSO組,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0

13、.05)。利福平處理后,可降低細胞對化療藥物敏感性。
　　 5.用RNAi技術特異性沉默LS174T細胞PXR基因表達,與野生型LS174T細胞和PXRi control細胞相比,PXRi1＃和PXRi2＃細胞中mRNA和蛋白表達均明顯受到抑制,而相應地MRP3表達也減弱。
　　 6.PXR敲低后,細胞增殖明顯受到抑制,野生型LS174T細胞和PXRi control細胞第3天、第5天、第7天的OD值分別為:0.496±

14、0.029、1.150±0.056、1.57±0.036和0.540±0.016、1.123±0.050、1.54±0.064,兩組值差異均不明顯,且均不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);PXRi1＃和PXRi2＃細胞第3天、第5天、第7天OD值分別為:0.313±0.019、0.640±0.040、0.782±0.073和0.284±0.009、0.680±0.026、0.835±0.059,均明顯低于相應PXRi control組,且

15、均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。PXR敲低后,可提高細胞對化療藥物的敏感性。在20μg/ml奧沙利鉑作用下,野生型LS174T細胞和PXRicontrol細胞存活率分別為:(36.8±5.4)％,(37.9±6.9)％;PXRi1＃和PXRi2＃細胞存活率分別下降至:(8.0±1.1)％,(11.4±2.2)％,與PXRi control組相比,且均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000;P=0.000)。在5μg/ml5-氟尿嘧啶作用下,野

16、生型LS174T細胞和PXRicontrol細胞存活率分別為:(78.9±5.3)％,(80.5±5.6)％;PXRi1＃和PXRi2＃細胞存活率分別下降至:(57.6±7.0)％,(62.3±6.7)％,與PXRi control組相比,且均具有統(tǒng)計學意義(P=0.008;P=0.029)。
　　 7.激光共聚焦顯微鏡顯示:5μM紫杉醇可增強LS174T細胞PXR表達,且向核濃聚,細胞膜MRP3表達也增強。表明紫杉醇活化PXR

17、后可上調LS174T細胞MRP3表達。
　　 8.DMSO組報告基因相對熒光活性是轉染Control組的兩倍多,但差異不具有統(tǒng)計學意義(4.67±0.60)×10-2vs(2.23±0.31)×10-2,P=0.095)。共轉染處理組分別經10μMRif和5μM Paclitaxel處理24h后,其相對熒光活性均明顯增強:利福平組為(7.93±0.91)×10-2,與DMSO組相比,升高具有統(tǒng)計學意義(P=0.025);紫杉醇組

18、為(12.30±1.85)×10-2,與DMSO組相比,升高更明顯,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 結論
　　 1.核受體PXR、MRP2和MRP3在結腸癌組織中差異上調,提示其與結腸癌耐藥相關;
　　 2.結腸癌及相應正常組織中,MRP3與核受體PXR mRNA表達呈正相關;
　　 3.核受體PXR配體利福平活化PXR,可促進結腸癌細胞增殖,降低結腸癌細胞化療敏感性;
　　 4.R