RNAi干擾MRP2表達(dá)逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對長春新堿的耐藥性.pdf

1、目的： 化療一直是以手術(shù)為主的大腸癌綜合治療的重要手段，而多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是臨床化療效果不佳的主要原因，多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制之一是多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistanceassociated protein2，MRP2)基因以及蛋白(ABCC2蛋白)的高表達(dá)。RNA干擾(RNA imerference，RNAi)自1998年Fire等[1]首次報(bào)道以來已成為一種特異性

2、抑制靶基因表達(dá)的有效工具。本研究通過構(gòu)建MRP2基因的小干擾RNA(small interfere RNA，siRNA)真核表達(dá)載體，觀測其對MRP2基因的沉默作用，探討應(yīng)用RNA干擾逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的可能性，探索促進(jìn)腫瘤治療的新策略，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)手段。 方法： 1.針對MRP2基因序列，篩選，設(shè)計(jì)，合成siRNA相關(guān)基因片段，構(gòu)建高特異性Pgenesil-1-MRP2-siRNA，酶切鑒定及測序驗(yàn)證插入序列正確性。

3、 2.脂質(zhì)體法將Pgenesil-1-MRP2-siRNA轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌耐長春新堿細(xì)胞株(HCT-8/V細(xì)胞株)，用定量RT-PCR和Western blot檢測siRNA阻斷MRP2的表達(dá)效率。 3.MTT實(shí)驗(yàn)測定Pgenesil-1-MRP2-siRNA和長春新堿對HCT-8/V細(xì)胞增殖抑制作用。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建出針對MRP2基因的siRNA表達(dá)載體：Pgenesil-1-MRP2-siRNA。

4、 2.用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染至HCT-8/V細(xì)胞，通過定量RT-PCR和Western blot檢測靶細(xì)胞MRP2-mRNA及蛋白(ABCC2蛋白)表達(dá)均較對照組明顯下降，其受抑制率分別為68.6％和75.9％(P＜0.05)。 3.在相同濃度化療藥物的作用下，MTT分析結(jié)果顯示RNA干擾組細(xì)胞凋亡比例高于對照組(P＜0.05)，表明細(xì)胞耐藥性下降。 結(jié)論： 1.應(yīng)用表達(dá)載體法成功構(gòu)建針對MRP2基因的siRN