長春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體的制備及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性作用研究.pdf

1、長春新堿是一種一線抗癌藥物，常以硫酸鹽形式存在，臨床應(yīng)用廣泛，但是長春新堿對神經(jīng)系統(tǒng)尤其是外周神經(jīng)的毒性以及易產(chǎn)生耐藥性限制了其在臨床上的應(yīng)用。奎寧是傳統(tǒng)的抗瘧藥物，但是已有研究發(fā)現(xiàn)其具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。因此，為了提高長春新堿對耐藥腫瘤的治療作用并減少毒副作用，本論文在探討奎寧逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)理的基礎(chǔ)上，制備了長春新堿與奎寧共載的脂質(zhì)體。具體研究工作分成以下幾個部分:
　　本文首先探討了奎寧在A549/T、HCT-8/V和MCF-7/

2、A三種耐藥細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制，主要考察了奎寧對細(xì)胞中ATP含量及ATP酶活性的影響和奎寧對耐藥細(xì)胞中耐藥蛋白P-gp表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明奎寧可以降低三種耐藥細(xì)胞中ATP的含量并能降低細(xì)胞中ATP酶活性，證明奎寧是P-gp蛋白的底物。另外奎寧并能降低三種耐藥細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)量，顯示出顯著的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。基于長春新堿和奎寧的溶解度，以大豆磷脂和膽固醇為原料，用薄膜水化法制備了長春新堿和奎寧的共載脂質(zhì)體，采用了SephadexG

3、-50凝膠柱層析法分離脂質(zhì)體與游離藥物以測定脂質(zhì)體的包封率，過程中以pH為7.4的PBS緩沖液為流動相進(jìn)行洗脫，之后采用溶劑甲醇對脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，使藥物逸出后，分別用HPLC法和UV法測定分離前后脂質(zhì)體中的長春新堿和奎寧的含量，計算兩種藥物的載藥量和包封率。同時考察了兩種藥物和磷脂的比例變化對包封率和載藥量的影響，發(fā)現(xiàn)長春新堿和奎寧的比例為1∶2時，包封率和載藥量都相對較高，因此篩選為最佳的處方，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。繼而考察了脂質(zhì)體的一系

4、列理化性質(zhì)，包括外觀、粒徑、電位和形態(tài)，結(jié)果顯示制備好的脂質(zhì)體的粒徑為62.47nm，PDI為0.283，另外考察脂質(zhì)體的體外藥物釋放行為，發(fā)現(xiàn)隨著pH的降低，長春新堿和奎寧在PBS種的釋放速率都有所增加，且不管是藥物共載脂質(zhì)體還是單載脂質(zhì)體混合，兩種藥物之間的釋放基本不會相互干擾。隨后考察了共載脂質(zhì)體的體內(nèi)外抗腫瘤效果。首先通過MTT實(shí)驗(yàn)測定了各個處方組對A549/T、HCT-8/V和MCF-7/A三種耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明共載

5、脂質(zhì)體在三種耐藥細(xì)胞上都有很強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)耐藥效果，IC50達(dá)到0.095±0.008μg/mL、1.36±0.25μg/mL和2.95±1.17μg/mL。同時考察了A549/T細(xì)胞、HCT-8/V細(xì)胞和MCF-7/A細(xì)胞在1h、2h、4h和8h四個時間點(diǎn)對長春新堿的攝取，通過HPLC方法測定細(xì)胞中長春新堿的含量，發(fā)現(xiàn)共載脂質(zhì)體組可以提高細(xì)胞對長春新堿的攝取。其次通過摸索，本論文構(gòu)建了A549/T細(xì)胞球模型和MCF-7/A細(xì)胞球模型，進(jìn)一步

6、考察了各處方組對細(xì)胞球的毒性，發(fā)現(xiàn)長春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體相比其他組而言，同樣具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。最后通過A549/T細(xì)胞裸鼠荷瘤模型，考察各組別藥物對荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用。結(jié)果顯示，長春新堿和奎寧共載脂質(zhì)體對腫瘤的抑制效果顯著優(yōu)于游離藥物組和脂質(zhì)體共混組，抑瘤率達(dá)到84.0％，體現(xiàn)了共載脂質(zhì)體在提高體內(nèi)抑瘤作用上的優(yōu)勢。綜上，長春新堿和奎寧的共載脂質(zhì)體能夠有效裝載藥物，并對A549/T、HCT-8/V和MCF-7/A腫瘤的耐藥性顯示