硫酸長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的研究.pdf

1、背景1962年，Beer等從長(zhǎng)春花中提取并分離得到了長(zhǎng)春堿（vinblastine,VLB）和長(zhǎng)春新堿（vincristine,VCR），經(jīng)過(guò)不斷探索研究，人們已從長(zhǎng)春花中分離得到70多種生物堿，臨床常用的該類(lèi)藥物有長(zhǎng)春堿（VLB）、長(zhǎng)春新堿（VCR）以及半合成的長(zhǎng)春瑞濱（vinorebine, VRB）和長(zhǎng)春地辛(vindesine，VDS)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春新堿在該類(lèi)藥物中抗腫瘤活性最強(qiáng)，具有很強(qiáng)的微管蛋白結(jié)合能力，同時(shí)還能抑制R

2、NA多聚酶活性并干擾蛋白質(zhì)合成，能夠很好抑制腫瘤細(xì)胞增殖。主要用于治療何杰金及非何杰金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病,也用于胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、軟組織肉瘤、支氣管肺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤，此外長(zhǎng)春新堿也用于治療血小板減少性紫癜。長(zhǎng)春新堿有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，缺乏選擇性，在臨床應(yīng)用中所導(dǎo)致的消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等藥物不良反應(yīng)（ADR）事件也較為常見(jiàn)，所以臨床常常采用聯(lián)合用藥的方式來(lái)降低長(zhǎng)春新堿的使用劑量，這是限制其發(fā)揮效應(yīng)的

3、重要因素。
　　脂質(zhì)體（liposome）是以磷脂為主要材料，組成的囊泡狀結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜相似，具有磷脂雙分子層，通過(guò)該結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)脂溶性和水溶性藥物包載，借助這一載體能夠?qū)崿F(xiàn)藥物靶向遞送，降低潛在毒性，提升藥物穩(wěn)定性。長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體（Long circulation thermosensitive liposome，LTSL）在普通脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上常使用PEG進(jìn)行修飾（如常用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，DSPE-PE

4、G2000），增大空間位阻，降低了脂質(zhì)體與血漿蛋白的結(jié)合，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的捕捉和吞噬，延長(zhǎng)了脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，同時(shí)PEG的引入也能夠防止脂質(zhì)體自身的聚集，提高制劑的穩(wěn)定性。其中，溫度敏感性磷脂的應(yīng)用，使脂質(zhì)體能夠在特定的相變溫度（Tm）將藥物釋放到加熱部位。當(dāng)達(dá)到該溫度時(shí)，脂質(zhì)體的磷脂膜由原來(lái)緊密的全反式構(gòu)象（膠晶態(tài)）轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷傻耐崤?gòu)象（液晶態(tài)），膜的流動(dòng)性也隨之大大提高，藥物更容易被釋放出來(lái)。通過(guò)使用不同的磷脂并調(diào)

5、整所占比例能夠制備得到不同相變溫度的熱敏脂質(zhì)體。研究表明，將少量溶血磷脂（MSPC）引入熱敏脂質(zhì)體能夠進(jìn)一步提高其對(duì)溫度的敏感性，加速在相變溫度下的狀態(tài)變化，提升釋藥速度。
　　目的制備長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體，借助腫瘤EPR效應(yīng)提高藥物的靶向性，降低常見(jiàn)毒性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)加熱后藥物的快速釋放，提高治療部位藥物濃度。與市售注射用硫酸長(zhǎng)春新堿比較，研究其細(xì)胞毒性及體內(nèi)抗腫瘤活性，評(píng)價(jià)長(zhǎng)春新堿熱敏脂質(zhì)體作為實(shí)體腫瘤治療的預(yù)期效果及可行性。

6、
　　內(nèi)容采用薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體，加壓過(guò)膜控制粒徑，pH梯度法主動(dòng)載藥，制備得到長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體（VCR-TSL，VTSL）。以外觀、粒徑、含量、包封率、熱敏特性、穩(wěn)定性等為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最優(yōu)的處方工藝。使用高效液相色譜法建立長(zhǎng)春新堿的含量及有關(guān)物質(zhì)分析方法，采用超濾離心法測(cè)定脂質(zhì)體包封率。利用透射電子顯微鏡測(cè)量并觀察脂質(zhì)體形態(tài)，采用激光粒度分析儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑。利用穩(wěn)定性分析儀追蹤長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體5個(gè)

7、月以上的穩(wěn)定性，同時(shí)測(cè)定含量、包封率、粒徑等變化。通過(guò)MTT法測(cè)定體外細(xì)胞毒性，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)記（Cou-6）脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用。進(jìn)一步建立裸鼠異種移植腫瘤模型，結(jié)合體外腫瘤部位加熱，對(duì)長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體的藥效學(xué)及毒性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果采用DPPC、DSPE-PEG2000、MSPC為磷脂膜材料。通過(guò)對(duì)水化液，粒徑控制工藝，冷凍保護(hù)劑用量和投料方法等進(jìn)行系統(tǒng)篩選優(yōu)化，確定了以薄膜分散法制備空白脂質(zhì)體，以

8、0.2M、pH3.0的酒石酸緩沖液為水化液，加壓過(guò)膜法控制粒徑以及pH梯度法主動(dòng)載藥的制備工藝。經(jīng)過(guò)處方優(yōu)化，制備得到的脂質(zhì)體平均粒徑在90nm左右；在透射電鏡下觀察，可見(jiàn)脂質(zhì)體的外觀圓整，粒徑大小分布均勻。該工藝制備得到的脂質(zhì)體藥物包封率能夠達(dá)到98％以上；多批樣品制備處方工藝重現(xiàn)性良好。長(zhǎng)期試驗(yàn)表明,脂質(zhì)體在-20℃條件下放置5個(gè)月穩(wěn)定性良好。體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)說(shuō)明長(zhǎng)春新堿長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體結(jié)合加熱可顯著增強(qiáng)細(xì)胞毒作用，在給藥后72h脂

9、質(zhì)體組中，sw620細(xì)胞活性均小于5%，PANC細(xì)胞活性均小于20%。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱敏脂質(zhì)體加熱后更易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熱敏脂質(zhì)體結(jié)合腫瘤局部加熱，具有良好的腫瘤增值抑制效果，抑瘤率達(dá)到了70%以上，同時(shí)，高劑量脂質(zhì)體組裸鼠體重和注射液組無(wú)顯著性差異，脂質(zhì)體組裸鼠進(jìn)食情況和活動(dòng)能力較注射液組優(yōu)，可以初步推斷能夠降低裸鼠全身毒性。
　　結(jié)論本研究制備得到的硫酸長(zhǎng)春新堿熱敏脂質(zhì)體具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，工藝穩(wěn)定重現(xiàn)性