hBAFF靶向載有長春新堿的脂質(zhì)體殺傷淋巴瘤細(xì)胞Raji的實驗研究.pdf

1、淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液病不僅患病率較高，而且治療困難。迄今為止，用于治療這些疾病的主要方法仍是化學(xué)治療，而化療藥物的劑量大小與治療效果直接相關(guān)，劑量過小則達(dá)不到治療目的，而劑量過大則會產(chǎn)生機(jī)體難以耐受的毒副作用。若能使化療藥物靶向聚集于癌組織細(xì)胞周圍，則不僅可降低藥物的使用劑量，而且會明顯提高治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，TNF家族的B細(xì)胞激活因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTN

2、Ffamily，BAFF)的受體不僅在正常B細(xì)胞上表達(dá)，而且在多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病及非何杰金淋巴瘤等的惡性B細(xì)胞上也有較高水平的表達(dá)。而BAFF突變體mBAFF-8(217-224八個氨基酸被兩個甘氨酸殘基替換的可溶性BAFF)只能結(jié)合BAFF受體，而不能活化淋巴細(xì)胞。此突變體在體內(nèi)可競爭與受體的結(jié)合，從而阻斷BAFF的生物學(xué)活性，抑制淋巴細(xì)胞的活化與增殖。因此，mBAFF-8不僅可用作BAFF的競爭抑制劑來治療相關(guān)的惡性血

3、液病，而且是一種理想的靶向載體。脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體，能使藥物靶向定位于特定的組織，激活機(jī)體自身的免疫功能，減少或降低藥物的毒性。為此，本項目在構(gòu)建了mBAFF-8cDNA高效表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，經(jīng)高效表達(dá)及純化制備具有受體結(jié)合能力但喪失淋巴細(xì)胞活化功能的BAFF突變體，超聲分散法制備包載化療藥物的脂質(zhì)體微粒，然后將mBAFF-8偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面制成靶向脂質(zhì)體藥物，進(jìn)而在體外比較所制靶向藥物和非靶向藥物殺傷Raji細(xì)胞的效果，最后觀

4、察靶向藥物對荷瘤SCID小鼠的抑瘤作用。所取得的主要研究結(jié)果如下： 1.將已構(gòu)建好的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/mBAFF-8轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，采用不同的誘導(dǎo)表達(dá)條件誘導(dǎo)目的融合蛋白的表達(dá)；經(jīng)Ni2+-NTA層析系統(tǒng)和SepharcrylS200凝膠過濾層析對融合蛋白進(jìn)行純化；經(jīng)MTT法檢測淋巴細(xì)胞的活化情況，鑒定mBAFF-8是否喪失了淋巴細(xì)胞活化功能。結(jié)果表明最佳表達(dá)條件是誘導(dǎo)時間4h，誘導(dǎo)溫度37℃，IPTG終濃度

5、0.2mmoL/L。mBAFF-8占菌體總蛋白的35％，蛋白純度達(dá)98％以上，所獲突變蛋白能與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合，但不能刺激淋巴細(xì)胞增殖。 2.薄膜超聲分散法制備長春新堿脂質(zhì)體，測得脂質(zhì)體平均粒徑大約150nm，包封率40％左右。 3.采用SPDP偶聯(lián)法，將mBAFF-8偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面制成靶向脂質(zhì)體藥物。 4.采用免疫熒光染色實驗鑒定所制靶向脂質(zhì)體中mBAFF-8與脂質(zhì)體的偶聯(lián)情況；靶向脂質(zhì)體與靶細(xì)胞結(jié)合的免

6、疫熒光染色實驗證明靶向脂質(zhì)體的靶向作用；以及細(xì)胞毒實驗(MTT法)評價體外所制靶向藥物和非靶向藥物殺傷淋巴瘤細(xì)胞Raji的效果；結(jié)果表明新型偶聯(lián)劑SPDP可使突變體mBAFF-8牢固地結(jié)合到脂質(zhì)體上并且能特異的與靶細(xì)胞結(jié)合；體外細(xì)胞毒實驗結(jié)果顯示，長春新堿靶向脂質(zhì)體對細(xì)胞生長的抑制作用有明顯的靶向?qū)Ｒ恍?，對人Raji細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用優(yōu)于普通脂質(zhì)體和游離藥物。 5.以Raji細(xì)胞尾靜脈注射SCID小鼠，建立了人Raji細(xì)胞荷瘤