Ad-TRAIL對T淋巴瘤細胞株殺傷作用研究套細胞淋巴瘤臨床預后分析.pdf

1、第1章：攜帶TRAIL基因的重組腺病毒對T淋巴瘤細胞株的殺傷作用研究1.研究背景&目的非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)為目前增長速度最快的惡性腫瘤，與西方國家相比，T細胞性非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-hodgkin'slymphoma,T-NHL)在中國、日本等亞洲人群中發(fā)病率較高，與B細胞性淋巴瘤(B-cell non-hodgkin's lymphoma，B-NHL)相比，T-NHL

2、的侵襲性更強，尚缺乏統(tǒng)一的治療標準，預后不佳。有必要尋找新的治療藥物和手段。有相當一部分的患者以結(jié)外局部發(fā)病為主，目前，對局部病灶的治療手段包括放療，電子線照射及氮芥外敷等，但這些治療方法的副作用較大，療效不佳。因此，亟需探尋新的局部治療手段。 在腫瘤的局部治療中，基因治療是一種全新的治療方法，目前已經(jīng)應用于臨床。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAI

3、L)作為外源性凋亡信號傳導的重要啟動因子，因能誘導多種腫瘤細胞凋亡而對正常組織和細胞沒有毒性受到廣泛關注。臨床前研究提示其為一種非常有前途的抗癌藥物，目前已經(jīng)進入臨床試驗階段。但TRAIL蛋白為系統(tǒng)給藥，作用于病灶局部的濃度較低，且其體內(nèi)半衰期過短，亦有多種腫瘤細胞株呈現(xiàn)出對TRAIL的耐藥，因此發(fā)現(xiàn)一個新的治療策略以克服TRAIL蛋白的藥代動力學的缺點并克服其耐藥有著很大的臨床應用價值。 利用基因載體介導TRAIL基因在瘤體內(nèi)

4、得到持續(xù)而穩(wěn)定的表達可以克服TRAIL蛋白的缺點，大大的改善治療效果。我們之前的和其他的研究結(jié)果也表明，通過用腺病毒為載體，能很好地將TRAIL基因轉(zhuǎn)染入多種腫瘤細胞表達膜連接的TRAIL而導致其凋亡，并因其產(chǎn)生膜連接的TRAIL有旁觀者效應(bystander effect)從而明顯增強TRAIL的抗腫瘤活性，而且可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對TRAIL蛋白的耐藥。攜帶TRAIL基因的重組腺病毒(Ad-TRAIL，AdT)已被證實對惡性黑色素瘤、

5、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞株有殺傷作用，顯示出了強大的抗腫瘤活性，但尚未有作用于T淋巴瘤細胞株的報道?；谝陨涎芯磕〉A，為了改善T-NHL的治療效果，進一步探索T-NHL的局部治療方法及擴大AdT的治療范圍，我們考慮研究AdT對T-NHL的體外抗腫瘤作用。 2.研究方法 人T細胞淋巴瘤Jurkat細胞株應用攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重組腺病毒

6、載體(Ad-GFP，AdG)處理，以熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光的表達情況；并以流式細胞儀分析細胞的GFP表達率。以AdT處理Jurkat細胞后，RT-PCR檢測不同時間TRAIL基因的表達情況；MTT法檢測不同感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)下的細胞毒作用；臺盼藍染色計數(shù)法檢測AdT作用不同時間細胞的生長狀況；采用Propidium Iodide(PI)單染流式細胞儀檢測凋亡。分別以MTT法和Pro

7、pidium Iodide(PI)單染流式細胞儀檢測AdT和化療藥物阿霉素(adriamycin，ADM)、依托泊苷(etoposide，VP-16)、長春新堿(vincristine，VCR)、地塞米松(dexamethasone，DXM)聯(lián)合用藥的細胞毒作用和細胞凋亡。 3.研究結(jié)果 3.1.腺病毒對Jurkat細胞的感染效率腺病毒可成功感染Jurkat細胞，病毒作用細胞48小時后于熒光顯微鏡下觀察，MOI為50時開

8、始看到GFP表達，表達量隨著感染病毒量的增加而逐漸增強；流式細胞儀檢測顯示，MOI為200時細胞GFP的表達率為(67.2±3.5)％；MOI為400時細胞GFP的表達率為(81.5±4.7)％。 3.2. AdT感染細胞后TRAIL基因的表達病毒感染后目的基因TRAIL可有效表達，并持續(xù)至感染后7天左右。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，AdT感染Jurkat細胞后，TRAIL基因的表達逐漸增高，第3大達到了高峰，隨后表達逐漸下降，第7天

9、只能檢測到TRAIL基因微弱的表達。而AdG感染的腫瘤細胞沒有出現(xiàn)TRAIL的目的條帶。 3.3.AdT抑制Jurkat細胞的增殖AdT作用細胞后，可抑制Jurkat細胞的增殖。MTT檢測顯示，AdT對腫瘤細胞的增殖抑制呈劑量依賴關系，AdG感染細胞后，并沒有明顯抑制Jurkat細胞的增殖；臺盼藍染色直接計數(shù)法顯示AdT感染細胞后對細胞的抑制作用隨時間延長而增加。 3.4.AdT誘導Jurkat細胞的凋亡PI染色流式細胞儀檢測發(fā)

10、現(xiàn)，AdT可誘導淋巴瘤細胞的凋亡，且隨著劑量增加，誘導凋亡作用增強。AdG感染細胞72小時后，與細胞對照組相比，凋亡率未見明顯增加。 3.5.AdT和化療藥物的聯(lián)合作用MTT和PI染色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，AdT和DXM聯(lián)合對Jurkat細胞的增殖抑制和誘導凋亡起協(xié)同作用，AdT和ADM、VP-16、VCR聯(lián)合對細胞的增殖抑制為單純相加作用。 4.結(jié)論 1.腺病毒載體可以成功轉(zhuǎn)染T淋巴瘤Jurkat細胞株，并能持續(xù)

11、有效地表達目的基因。 2. AdT感染Jurkat細胞后對細胞株有增殖抑制作用，并呈劑量和時間依賴性。 3. AdT主要通過誘導Jurkat細胞凋亡而抑制增殖。 4.AdT與DXM聯(lián)合對Jurkat細胞的增殖抑制和誘導凋亡可能有協(xié)同作用。 5.AdT和ADM、VP-16、VCR聯(lián)用對Jurkat細胞的增殖抑制為單純相加作用。 第2章：套細胞淋巴瘤臨床預后分析1.研究背景&目的套細胞淋巴瘤(mant

12、le cell lymphoma，MCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma，NHL)的一種少見亞型，診斷時多為晚期(AnnArbor分期Ⅲ～Ⅳ期)，采用目前的標準治療方法不可治愈。初治時雖然對治療反應敏感，但緩解期短，復發(fā)率較高，復發(fā)后疾病更具侵襲性且對治療反應變差，緩解期明顯縮短。MCL的中位牛存期僅3～4年，屬于NHL中預后最差的亞型之一。目前國內(nèi)尚無大宗病例的報道。本研究的目的在于探討中國人MCL的臨床

13、病理特征，診治方法和影響預后的因素。 2.研究方法回顧性分析2000年到2007年中山大學腫瘤防治中心和南方醫(yī)院收治的45例MCL患者。收集其臨床資料如年齡、分期、PS、國際預后指數(shù)評分等和治療效果、生存情況，采用Kaplan-meier法進行生存分析，采用Log-rank檢驗和COX部分風險模型進行預后因素分析。 3.研究結(jié)果 全組患者中位年齡56歲(23～76歲)；男女之比為3.5:1；33例患者(73.3％)以全身

14、淋巴結(jié)腫大為首發(fā)癥狀；初診時，27例(60.0％)有結(jié)外侵犯，37例(82.2％)為晚期病例(Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期)；26例(57.8％)患者國際預后指數(shù)大于1分。僅有16例(35.6％)患者在初次病理診斷時能夠明確分型，29例患者被誤診為其他亞型。43例患者接受聯(lián)合化療，總反應率為76.7％，接受CHOP方案或類似方案化療的患者總反應率和完全緩解率分別為73.3％和30.0％；接受R-CHOP或類似方案化療的患者總反應率和完

15、全緩解率分別為81.8％和72.7％。中位隨訪時間38個月，全組患者的5年總生存率為17.3％，2年無病生存率為27.2％，3年無病生存率為0。中位無進展生存期20個月。CHOP組和R-CHOP組的總生存率及無病生存率無顯著性差異。29例(64.4％)患者在隨訪過程中出現(xiàn)疾病復發(fā)或進展。本研究中，單因素分析顯示，MCL的預后因素包括治療前PS、LDH、B癥狀、骨髓侵犯、外周血侵犯。多因素分析結(jié)果顯示，只有PS和骨髓侵犯為影響MCL總生存