C6神經酰胺增敏長春新堿抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　傳統(tǒng)腫瘤化療藥（如長春新堿）使用存在嚴重局限，腫瘤細胞對傳統(tǒng)腫瘤化療藥存在先天或獲得性耐藥，這是由于藥物轉運蛋白水平或活性的改變，以及影響藥物的活性和/或代謝的蛋白的影響?；熢雒舻鞍滓恢笔前┌Y研究的一大焦點。許多研究者已經發(fā)現(xiàn)的短鏈細胞滲透性神經酰胺(C6)的活性，以增加現(xiàn)有的化療藥物的抗腫瘤活性。C6神經酰胺顯著提高的多個抗癌藥物的活性，包括紫杉醇、阿霉素和組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)。但這個增敏

2、的分子機制仍然是不明確。
　　長春新堿是一種常用的抗癌化療藥物。它是一種細胞周期特異性的藥物，結合于微管蛋白，抑制微管結構的組裝和阻止有絲分裂的中期，使癌細胞不能發(fā)生有絲分裂。它已被廣泛地應用于各種類型的化療方案用于治療患者腫瘤，在不同的癌癥中其有效率變化大，使用后癌細胞會表現(xiàn)出耐藥的趨勢發(fā)展。長春新堿誘導癌細胞死亡的分子機制仍然不清楚。我們以前的研究已經表明，激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)可能是介導長春新堿活性的關鍵信號。我

3、們團隊一直注重AMPK對癌細胞的抑制能力。持續(xù)激活AMPK示通過調節(jié)多個下游信號的目標來誘導癌細胞死亡和生長抑制，包括在活化的mTOR復合體1(mTORC1)、磷酸化的p53、激活自噬，等等。
　　這里我們顯示，在多個人類癌細胞系中，無論是在體內和體外， C6神經酰胺顯著地提高了長春新堿誘導的抗癌活性。在分子水平上，我們發(fā)現(xiàn)AMPK依賴性p53活化可能是介導的敏化效應關鍵的信號。
　　研究方法和材料：
　　人結腸癌HC

4、T-116細胞，人胰腺癌PANC-1細胞和人卵巢癌A2780細胞中，所有細胞均從上海生命科學研究院（上海，中國）購買，并維持在RPMI/DMEM培養(yǎng)基中（Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州），加入10％的FBS（Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州），青霉素/鏈霉素(1∶100，Sigma)，培養(yǎng)在37℃CO2培養(yǎng)箱中。細胞給予指定的C6神經酰胺和或長春新堿處理，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，運用MTT方法檢測細胞存活率，同時對細胞進行臺盼藍染色

5、，計算活細胞率;運用組蛋白DNA-ELISA及AnnexinⅤ試劑盒檢測細胞凋亡，LDH分析法檢測細胞死亡率，線粒體免疫共沉淀分離線粒體，通過JC-10染料測定細胞線粒體膜電位(MMP)，Western blot檢測總的和磷酸化的AMPKα、ACC、P53、CYP-D、Bcl-2、HIF-1α、S6K1等信號通路的改變;運用程序性死亡抑制劑及凋亡抑制劑進一步驗證C6神經酰胺和長春新堿誘導細胞死亡方式。建立CYP-D-shRNA、p53-

6、shRNA、AMPKα1-shRNA及AMPK-α1顯性失活(DN)突變（DN-AMPK-α1）cDNA穩(wěn)轉的腫瘤細胞，運用上述方法進一步驗證信號通路的改變。制備脂質體C6神經酰胺，運用上述方法驗證其體外活性，建立裸鼠模型，予以分組靜脈給藥，記錄裸鼠存活率，腫瘤大小，免疫組化檢測組織AMPKα表達，進一步驗證脂質體C6神經酰胺增強長春新堿的抗腫瘤機制。
　　統(tǒng)計學處理
　　在每個實驗中，至少使用三個孔/平皿。每個實驗重復至少

7、三次，每次獲得具有相似的結果。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準偏差(SD)。使用SPSS15.0軟件進行分析統(tǒng)計，通過one-way ANOVA，Scheffe和Tukey檢驗。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。試劑的濃度和治療持續(xù)時間基于發(fā)表文獻和預實驗的結果。
　　研究結果：
　　1、C6神經酰胺在多個人腫瘤細胞系顯著提高了長春新堿誘導的腫瘤細胞毒性。長春新堿單獨只有適度抑制HCT-116結腸癌細胞存活，與C6神經酰胺共同用藥顯著增加長春

8、新堿的活性，從而導致細胞活力大幅降低。C6神經酰胺的效果是劑量依賴性的，2.5-10.0μg/mL的C6能夠顯著增加長春新堿的活性，而C6神經酰胺本身對HCT-116細胞的存活率幾乎沒有影響。C6神經酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥導致了大量的細胞死亡，并且聯(lián)合效果比任一單獨藥劑顯著高。另外兩個人癌細胞系A2780卵巢癌細胞和PANC-1胰腺腫瘤細胞，同樣觀察到協(xié)同作用。
　　2、C6神經酰胺促進長春新堿誘導的凋亡和程序性壞死。使用組蛋白D

9、NA的ELISA測定法和膜聯(lián)蛋白V FACS測定法進行細胞凋亡的檢測，結果表明，長春新堿（1μM）單獨用藥僅誘導極少的HCT-116細胞凋亡，而與C6神經酰胺(10μg/mL)共用藥顯著增強效果。C6神經酰胺對細胞凋亡的增敏作用幾乎被廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK抑制。通過LDH釋放的增加檢測長春新堿誘導的HCT-116細胞程序性壞死，C6神經酰胺的共同用藥處理明顯增加細胞程序性壞死，而壞死抑制劑necrostatin-1(

10、NEC-1)抑制了聯(lián)合用藥的效果。重要的是，Z-VAD-FMK或NEC-1單獨可部分抑制C6神經酰胺加長春新堿誘導的細胞毒性，但兩者聯(lián)合可幾乎阻斷。需要注意的是NEC-1比Z-VAD-FMK減輕細胞毒性更有效。類似的結果在A2780卵巢癌細胞和PANC-1胰腺癌細胞中也見到。
　　3、C6神經酰胺和長春新堿協(xié)同激活AMPK依賴性的mTORC1的抑制以及細胞凋亡和程序性壞死。Western blot的結果表明，在HCT-116細胞和

11、A2780細胞中，C6神經酰胺和長春新堿協(xié)同活化AMPK通道，比任一藥物單獨使用更有效。通過磷酸化S6K1(Thr-389)的檢測反應mTORC1活化的，并且對mTORC1依賴性基因，包括Bcl-2和HIF-1α的表達的檢測，發(fā)現(xiàn)共同用藥后比單藥mTORC1相關蛋白水平顯著下調。類似的結果在A2780細胞中也見到。在共同給藥刺激的腫瘤細胞中，無論是AMPK的激活抑制，還是由基因沉默（shRNA敲低表達）或通過引入顯性失活(DN)的突變，

12、都可恢復S6K1磷酸化和Bcl-2/HIF-1α的表達。重要的是，在HCT-116細胞中，C6神經酰胺加長春新堿引起的細胞活力下降，細胞凋亡和細胞壞死都被AMPK沉默或失活突變所抑制。
　　4、C6神經酰胺和長春新堿協(xié)同誘導AMPK依賴的p53激活，使其易位到線粒體，與線粒體通透性轉換孔(mPTP)相關蛋白親環(huán)素D(Cyp-D)絡合形成復合物。C6神經酰胺或長春新堿單獨誘導HCT-116細胞中度p53的活化（磷酸化和上調）。兩者聯(lián)

13、合用藥引起p53的活化進一步增加，抑制AMPK（shRNA沉默或基因突變）抑制p53活化。Western blot檢測線粒體蛋白質表明C6神經酰胺加長春新堿導致p53的轉位到線粒體，p53和磷酸化p53兩者都前往線粒體。此外，線粒體-IP實驗結果表明，p53的易位與Cyp-D的形成復合物，這個復合物被AMPK或Cyp-D的沉默所抑制。另外，Western blot檢測表明通過共同給藥后p53基因易位被AMPK沉默抑制，但不被Cyp-D沉

14、默抑制。反之，AMPK激活AICAR誘導p53的激活，導致p53線粒體易位，以及與Cyp-D結合。通過JC-10染料檢測刺激后HCT-116細胞中的MMP，結果表明，C6神經酰胺和長春新堿協(xié)同降低MMP，比單獨給藥更有效。通過相對應的shRNA沉默AMPK或Cyp-D抑制聯(lián)合用藥所誘導的MMP減少。
　　5、線粒體蛋白質Cyp-D需要的C6神經酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥引起壞死，但不是凋亡。Cyp-D抑制劑環(huán)孢菌素A(CSA)以及sh

15、RNA敲低Cyp-D幾乎阻斷聯(lián)合用藥誘導的細胞壞死，而留下的細胞凋亡不受影響。C6神經酰胺加長春新堿誘導的細胞活力降低被Cyp-D-抑制減少。通過的shRNA沉默p53不僅抑制聯(lián)合用藥誘導的壞死，而且還抑制了細胞凋亡。
　　6、脂質體的C6神經酰胺在體外和體內高效增敏長春新堿的活性。根據(jù)以前的操作規(guī)程成功合成了脂質體C6神經酰胺。體外研究結果表明，該脂質體C6神經酰胺增強長春新堿誘導的HCT-116細胞和A2780細胞活力降低和凋

16、亡，并且比非脂質體的C6神經酰胺具有更高的效率。在體內，脂質體C6神經酰胺加長春新堿聯(lián)合對小鼠模型給藥，發(fā)現(xiàn)HCT-116或A2780異種移植生長受到顯著抑制。脂質體的C6神經酰胺或長春新堿作為單一給藥，發(fā)現(xiàn)HCT-116或A2780在體內生長的只略微受到抑制。IHC檢測結果表明，在腫瘤異種移植模型中脂質體的C6神經酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥（48小時）也可誘導顯著AMPK磷酸化/活化，并與非脂質體的C6神經酰胺的結果相一致。小鼠體重也不受

17、上述藥物使用的影響。
　　研究結論：
　　1、C6神經酰胺大幅增敏長春新堿誘導腫瘤細胞凋亡和程序性壞死。
　　2、C6神經酰胺和長春新堿協(xié)同激活AMPK-P53，調節(jié)細胞凋亡和程序性壞死。
　　3、聯(lián)合用藥后AMPK的活化導致mTOR抑制和Bcl-2/HIF-1α的降解。
　　4、聯(lián)合用藥后AMPK依賴性的p53與Cyp-D-線粒體結合介導程序性壞死。
　　5、在體外和體內脂質體C6神經酰胺敏化長春新