C6神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和信號(hào)機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　結(jié)腸癌是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。耐藥性及對(duì)正常細(xì)胞的毒性限制了目前的化療方案治療結(jié)腸癌效果。尋找化療替代藥物是目前臨床及基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。
　　目的:
　　在體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌HT-29中，我們研究了具有細(xì)胞通透性的短鏈神經(jīng)酰胺C6（C6ceramide）細(xì)胞毒性作用，重點(diǎn)明確其細(xì)胞毒作用的機(jī)制。
　　方法:
　　MTT（3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-2，5-二苯基溴化）法，集落形成試驗(yàn)和臺(tái)

2、盼藍(lán)被用來(lái)測(cè)試的HT-29細(xì)胞存活。AnnexinV染色，組蛋白-DNAELISA法和Caspase-3活性法用來(lái)評(píng)估HT-29細(xì)胞凋亡。包括Ulk1、LC3B及Beclin-1自噬相關(guān)蛋白用Westernblot檢測(cè)。Westernblots測(cè)定磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(5'-AMPactivatedproteinkinase，AMPK)激活。AMPK的活性調(diào)控則由shRNA敲除或基因突變（組成性激活，CA）來(lái)完成。
　　結(jié)果:<

3、br>　　我們觀察到C6神經(jīng)酰胺劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞死亡。然而，在C6神經(jīng)酰胺處理的HT-29細(xì)胞中，并沒(méi)有觀察到顯著的細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，在HT-29細(xì)胞中，C6神經(jīng)酰胺自噬性細(xì)胞死亡。自噬抑制劑3-methyaldenine(3-MA)和羥氯喹抑制C6神經(jīng)酰胺的細(xì)胞毒作用，而自噬激活劑依維莫司(RAD001)和temsirolimus模擬C6神經(jīng)酰胺的作用，并誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞死亡。此外，運(yùn)用分子生物學(xué)方法，我們證實(shí)