神經(jīng)酰胺誘導膀胱癌細胞凋亡的機制研究及其與絲裂霉素C聯(lián)合應用的效果分析.pdf

1、本研究共分三個部分論述了神經(jīng)酰胺誘導膀胱癌細胞凋亡的機制研究及其與絲裂霉素C聯(lián)合應用的效果分析。首先，探討神經(jīng)酰胺對人膀胱癌細胞的凋亡誘導作用及其可能的分子機制；然后，以絲裂霉素C(MMC)為代表檢測化療藥物與神經(jīng)酰胺聯(lián)合應用是否可以協(xié)同抑制人膀胱癌細胞生長；最后，探討MMC與神經(jīng)酰胺發(fā)揮協(xié)同抑瘤作用的機制。 研究材料與方法： 1、C<,2>-神經(jīng)酰胺(C<,2>-Cer)對BIU-87細胞生長的抑制作用C<,2>-Ce

2、r處理BIU-87細胞，然后采用四甲基偶氮唑蘭(MTT)法測定細胞生長的抑制率，抑制率=[(對照組A<,490>值-加藥組A<,490>值)/對照組A<,490>值]x100％。 2、協(xié)同效應檢測試驗共分4組：(1)絲裂霉素C(MMC)組：MMC終濃度分別為11.964、23.928、47.856、95.711、191.422 μmol/L； (2)C<,2>-Cer組：C<,2>-Cer終濃度分別為2.500、5.000、10

3、.000、20.000、40.000 μmol/L； (3)聯(lián)合用藥組：同時加入、MMC和C<,2>-Cer，終濃度分別為：11.964和2.500、23.928和5.000、47.856和10.000、95.711和20.000、191.422和40.000μmol/1； (4)未經(jīng)任何藥物處理的細胞作為對照。MTT法檢測細胞生長抑制率，計算公式：抑制率=[(對照組A值-試驗組A值)/對照組A值]×100％。采用CHOU-TALALA

4、Y聯(lián)合指數(shù)法判定藥物之間相互作用的效果。 3、細胞凋亡形態(tài)學檢測收集經(jīng)不同濃度MMC和C<,2>-Cer處理后的細胞，磷酸鹽緩沖液洗2次，調(diào)整細胞濃度為1x10<'7>個/mL。吖啶橙(A0)熒光染色，熒光顯微鏡下觀察。 4、細胞凋亡率檢測收集經(jīng)不同濃度MMC和C<,2>-Cer處理后的細胞，碘化丙啶(PI)染色法用流式細胞儀檢測細胞凋亡，采集軟件CellQuest 3.0，分析軟件ModFit，結果用百分率表示。

5、 5、Caspase-3活性檢測Caspase-3活性是依據(jù)底物DEVD-pNA被活性Caspase-3分解后產(chǎn)生的pNA單體在405nm波長的吸光度(A<,405>)值與Caspase-3活性成正相關而間接測定。收集經(jīng)不同濃度MMC和C<,2>-Cer處理后的細胞按照試劑盒說明書操作，紫外分光光度計在405nm波長測定A<,405>值，以。4405值大小表示Caspase．3活性。 6、細胞色素C亞細胞分布及Bcl．2蛋白表

6、達水平變化的檢測按照線粒體/細胞漿分離試劑盒說明書的步驟提取線粒體和細胞漿蛋白，參照文獻提取細胞總蛋白。蛋白樣品用考馬斯亮藍法進行定量。細胞總蛋白作Bcl-2蛋白含量分析，細胞漿和線粒體蛋白作細胞色素C含量分析。以40μg蛋白上樣量進行十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，．抗體孵育、顯色。對條帶進行灰度掃描，以目的條帶和內(nèi)參照灰度的比值表示蛋白含量。 7、統(tǒng)計學分析t檢驗或q檢驗。

7、研究結果： 隨C<,2>-Cer濃度增加，抑制率逐漸增加(表1-1)。抑制率與C<,2>-Cer濃度呈正相關(r=0.979，P<0.05)。C<,2>-Cer處理后，可見細胞出現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)學改變(圖1-1)。FCM檢測BIU-87細胞凋亡率隨C<,2>-Cer濃度增加而逐漸增加(P<0.05)(圖1-2)。隨C<,2>-Cer濃度增加，Caspase-3活性逐漸增加。對照組細胞漿內(nèi)細胞色素C表達陰性，細胞色素C僅存在于線

8、粒體內(nèi)。C<,2>-Cer處理組線粒體內(nèi)細胞色素C含量顯著低于對照組(P<0.05)，同時在細胞漿內(nèi)可檢測到細胞色素C(圖1-3)。對照組和C<,2>-Cer處理組均有：Bcl-2蛋白表達，但C<,2>-Cer處理組表達水平顯著低于對照組(P<0.05)(圖1-4)。 MMC與C<,2>-Cer單獨及聯(lián)合應用對BIU-87細胞的生長均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，對細胞生長的抑制作用也增加(表2-1)。MMC、C<,2>-Ce

9、r合用時各自的中效濃度分別是單用時的35.0％和40.6％。MMC和C<,2>-Cer單獨應用時的中效方程分別是：D=153.003(fa/fu)<'0.771>和D=26.644(fa/fu)<'0.649>·649，MMC和C<,2>-Cer聯(lián)合應用時的中效方程分別是：D=54.325(fa/fu)<'0.665>和D=11.350(fa/fu)<'0.665>。在整個效應范圍內(nèi)兩種藥物均存在協(xié)同效應(CI<1) (表2-2、圖2-

10、1)。 兩種藥物在各濃度聯(lián)合應用時的凋亡率均高于各自單用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) (表3-1、圖3-1、3-2)。MMC、C<,2>-Cer單用和聯(lián)合應用均可見部分細胞出現(xiàn)體積縮小，細胞核染色質(zhì)固縮、聚集于核膜下或碎裂成數(shù)個黃綠色強熒光顆粒等凋亡的特征性形態(tài)學改變，聯(lián)合用藥表現(xiàn)最為明顯(圖3-3)。MMC、C<,2>-Cer單獨和聯(lián)合應用均可導致Caspase-3活性升高，聯(lián)合用藥Caspase-3活性升高更為明顯(P

11、<0.05)。 MMC、C<,2>-Cer單獨及聯(lián)合應用均可使線粒體內(nèi)細胞色素C向細胞漿釋放，導致線粒體內(nèi)細胞色素C含量下降，MMC、C<,2>-Cer單獨及聯(lián)合用藥時，BIU-87細胞線粒體細胞色素C含量均顯著低于對照組(P均<0.05)，聯(lián)合用藥時線粒體細胞色素C含量顯著低于MMC和C<,2>-Cer單獨應用(P均<0.05)(圖3-4)。對照組細胞漿內(nèi)細胞色素C陰性，MMC、C<,2>-Cer單獨及聯(lián)合用藥細胞漿內(nèi)均有細胞色素C出

12、現(xiàn)，聯(lián)合用藥時細胞漿內(nèi)細胞色素C含量顯著高于MMC和C<,2>-Cer單獨應用(P均<0.05) (圖3-5)。 研究結論： 1、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平、促進線粒體內(nèi)細胞色素C向細胞漿的釋放和Caspase-3的激活可能是C<,2>-Cer誘導膀胱癌細胞凋亡的重要機制。 2、MMC與C<,2>-Cer聯(lián)合應用可以通過共同誘導細胞凋亡，協(xié)同抑制膀胱癌細胞生長。 3、線粒體細胞色素C釋放和Casp