絲裂霉素聯(lián)合尼美舒利對膀胱癌EJ細胞的影響及其機制研究.pdf

1、膀胱癌是最常見的泌尿系腫瘤,單純手術切除后復發(fā)率較高,腫瘤復發(fā)的預防是目前研究重點,聯(lián)合應用不同作用機制的藥物取得了較好的效果,目前國內(nèi)外針對尼美舒利聯(lián)合絲裂霉素作用于膀胱癌的研究較少。
　　 目的:
　　 研究環(huán)氧化酶-2(Cox-2)選擇性抑制劑尼美舒利(NIM)與絲裂霉素(MMC)聯(lián)合應用對體外培養(yǎng)人膀胱癌細胞株EJ細胞增殖,凋亡及細胞周期的影響,研究凋亡相關基因Bax和Bcl-2兩種蛋白在EJ細胞上的表達情況。<

2、br>　　 方法:
　　 1細胞選用人膀胱癌EJ細胞,作用培養(yǎng)時間分別為24 h、48 h、72 h。
　　 2實驗分組:采用隨機對照原則分對照組和實驗組,對照組即不做處理的細胞培養(yǎng)液作陰性對照,實驗組按實驗藥物不同分3組:MMC組:濃度為2mg／L；NIM組:濃度300 umol／L；聯(lián)合組:MMC(2mg／L)+NIM(300 umol／L)。
　　 3對照組和實驗組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,MTT

3、檢測細胞增殖抑制情況。
　　 4對照組和實驗組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,通過流式細胞儀(FCM)用AnnexinV-EGFP檢測細胞凋亡,用PI染色檢測細胞周期。
　　 5對照組和實驗組培養(yǎng)48 h,用S-P免疫組織化學染色法觀察人膀胱癌細胞株中Bax和Bcl-2蛋白的表達情況。
　　 6實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用方差分析進行統(tǒng)計,P<0.05

4、有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.MTT法測定處理后EJ細胞增殖的抑制情況
　　 在藥物作用24h、48h、72h后,不同培養(yǎng)時間的平均細胞數(shù)減少,實驗組即MMC組、NIM組、聯(lián)合組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在相同的作用因素下,作用72h后分別與24h、48h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在相同作用時間內(nèi),聯(lián)合組與兩個單藥組之間比較,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明

5、藥物處理對細胞能產(chǎn)生一定的抑制效應,并且隨時間延長,實驗組活細胞的數(shù)量減少,以處理72h后聯(lián)合組的活細胞數(shù)量減少最明顯。
　　 2.流式細胞儀檢測EJ細胞的結果:
　　 2.1 EJ細胞凋亡率:
　　 在作用24h,48h,72h后,在相同作用時間內(nèi),實驗組僅MMC組、聯(lián)合組與對照組之間的細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),NIM組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在相同處理因素作用下,隨時間

6、延長,MMC組和聯(lián)合組凋亡細胞百分率均有所增加,但這兩個組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),NIM組凋亡細胞百分率隨時間延長無明顯變化(P>0.05)。
　　 2.2 EJ細胞死亡率:
　　 在作用24h,48h,72h后,在相同作用時間內(nèi),實驗組與對照組之間的細胞死亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),在相同處理因素作用下,隨時間延長,實驗組各組間死亡細胞百分率均有所增加,以處理72h后聯(lián)合組細胞死亡數(shù)量最多,有統(tǒng)

7、計學意義(P<0.05)。
　　 3.流式細胞儀檢測EJ細胞的細胞周期分布:
　　 在作用24h,48h,72h后,在相同作用時間內(nèi),實驗組僅NIM組、聯(lián)合組與對照組之間的G1期的細胞百分數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),MMC組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在相同處理因素作用下,隨時間逐漸延長,NIM組和聯(lián)合組將細胞阻斷于G1期的細胞百分數(shù)均有所增加,但這兩個組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說

8、明NIM可影響細胞周期并阻斷膀胱癌EJ細胞于G1期。
　　 4.免疫組化法觀察處理48h后細胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達情況:
　　 免疫組化結果顯示,MMC組、NIM組、聯(lián)合組中Bax蛋白的表達有所增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合組與MMC組,NIM組比較也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩個單藥組Bax蛋白表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。MMC組、NIM組、聯(lián)合組中Bcl-2蛋

9、白的表達均降低,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聯(lián)合組與MMC組,NIM組比較也有統(tǒng)計學意義。兩個單藥組Bcl-2蛋白表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。聯(lián)合組Bcl-2蛋白的表達呈陰性。
　　 結論:
　　 絲裂霉素聯(lián)合尼美舒利對于抑制體外培養(yǎng)的膀胱癌EJ細胞增殖有協(xié)同作用；
　　 Cox-2抑制劑尼美舒利可增強EJ細胞對絲裂霉素的敏感性,其機制可能與尼美舒利與細胞周期阻滯于G1期有關；