小白菊內(nèi)酯對人膀胱癌5637細胞的體外抑制及其機制的研究.pdf

1、第一部分、小白菊內(nèi)酯對人膀胱癌5637細胞增殖和細胞周期的影響
　　 目的：研究小白菊內(nèi)酯(Parthenolide)在體外對人膀胱癌細胞系5637細胞增殖和細胞周期的影響及其可能機制。
　　 方法：采用MTT法觀察不同濃度的小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用不同時間(24h和48h)后對人膀胱癌細胞系5637細胞增殖的影響。同時應用集落形成試驗觀察不同濃度的小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和1

2、0μM)對5637細胞集落形成的影響。獲取不同濃度小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用24小時的5637細胞，碘化丙錠(PI)染色后經(jīng)流式細胞儀檢測，并對獲取數(shù)據(jù)進行細胞周期分析。應用Westernblotting方法檢測與細胞周期調(diào)節(jié)相關蛋白CyclinD1和CDK2、p-CDK2、CDK4的表達，來觀察小白菊內(nèi)酯對其表達水平的影響。
　　 結果：
　　 1.小白菊內(nèi)酯能顯著抑制人膀胱癌5637細胞的

3、增殖，并隨藥物濃度的升高(2.5-10μM)和作用時間的延長(24h-48h)，其抑制作用增強，呈明顯的濃度和時間依賴性。
　　 2.在2.5-10μM濃度的小白菊內(nèi)酯對人膀胱癌5637細胞作用24h后的抑制率分別為9.5-40％，而在48h后的抑制率分別變?yōu)?3.9-79％。
　　 3.小白菊內(nèi)酯能顯著抑制人膀胱癌5637細胞集落形成，并隨著濃度的增高集落形成率逐步下降，在濃度10μM時集落形成抑制率達到87.7％。<

4、br>　　 4.經(jīng)流式細胞儀檢測，不同濃度小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用人膀胱癌5637細胞24小時后，可以使G1期細胞增多，出現(xiàn)G1期阻滯，并呈劑量依賴性；S期細胞減少；G2/M期細胞與對照組比較無明顯變化。
　　 5.小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用人膀胱癌5637細胞24小時后，隨著作用濃度的增加，可以使CyclinD1和p-CDK2減少，并有顯著的濃度依賴性。
　　

5、 結論：小白菊內(nèi)酯能顯著抑制人膀胱癌5637細胞的增殖和集落形成，其抑制作用呈時間和劑量依賴性。小白菊內(nèi)酯能顯著抑制5637細胞中CyclinD1和p-CDK2的表達，其可能是誘導5637細胞G0/G1期阻滯的分子機制之一。
　　 第二部分、小白菊內(nèi)酯對人膀胱癌5637細胞凋亡的誘導作用
　　 目的：研究小白菊內(nèi)酯在體外對人膀胱癌細胞系5637細胞的凋亡誘導作用，并探討其誘導凋亡的相關分子機制。
　　 方法：用H

6、oechst(HO33258)熒光染色法觀察經(jīng)小白菊內(nèi)酯作用后5637細胞具有的凋亡形態(tài)學改變。采用流式細胞儀(PI和annexinⅤ雙染法)檢測細胞凋亡率的變化。采用Westernblotting方法檢測不同濃度小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用48小時后5637細胞中NF-κB信號通路的改變。同時研究了PARP，Bcl-2家族等蛋白在小白菊內(nèi)酯誘導細胞凋亡中表達水平的變化。
　　 結果：
　　 1

7、.不同濃度小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用于5637細胞48小時后能明顯誘導細胞凋亡，凋亡的誘導作用呈顯著劑量依賴性。
　　 2.熒光顯微鏡顯示不同濃度小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,7.5和10μM)作用于5637細胞48小時后使細胞密度呈劑量依賴性降低。同時觀察到凋亡細胞所具有的典型形態(tài)學改變。
　　 3.通過流式細胞儀(PI和annexinⅤ雙染法)檢測發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯作用于5637細胞48小時

8、后細胞凋亡呈劑量依賴性增加。小白菊內(nèi)酯(2.5-10μM)作用48小時后產(chǎn)生的早期凋亡細胞分別為8.1％-16.5％，晚期凋亡細胞分別為7.0％-70.1％，總的凋亡細胞為15.1％-86.6％。
　　 4.小白菊內(nèi)酯(0-10μM)作用5637細胞48小時后，隨著作用濃度的增加，5637細胞PARP被激活，呈顯著的濃度依賴性，表現(xiàn)為裂解的PARP片段(89KD)出現(xiàn)。
　　 5.小白菊內(nèi)酯(0-10μM)作用5637細

9、胞48小時后，隨著作用濃度的增加，5637細胞中磷酸化IκBα(p-IκBα)的表達逐漸降低，并呈濃度依賴性，但不影響IκBα的表達。
　　 6.小白菊內(nèi)酯(0-10μM)作用5637細胞48小時后，隨著作用濃度的增加，5637細胞中Bcl-2和磷酸化Bad(p-Bad)的表達逐漸降低，呈顯著的濃度依賴性。
　　 結論：小白菊內(nèi)酯能誘導人膀胱癌細胞系5637細胞凋亡，凋亡的誘導作用呈顯著劑量依賴性。小白菊內(nèi)酯能顯著抑制5

10、637細胞中NF-κB信號通路的激活，進而調(diào)節(jié)Bcl-2家族等蛋白表達變化，并最終誘導凋亡的發(fā)生。
　　 第三部分、小白菊內(nèi)酯對人膀胱癌5637細胞侵襲轉移的影響
　　 目的：研究小白菊內(nèi)酯在體外對人膀胱癌細胞系5637細胞遷移侵襲能力的影響及其可能機制。
　　 方法：利用Transwell小室侵襲和轉移實驗檢測小白菊內(nèi)酯對5637細胞遷移和侵襲能力的影響。采用RT-PCR方法檢測小白菊內(nèi)酯(0,2.5，5.0,

11、7.5和10μM)作用48小時后的5637細胞中VEGFmRNA、MMP-2mRNA、MMP-9mRNA水平的表達。
　　 結果：
　　 1.小白菊內(nèi)酯(0-10μM)作用5637細胞48小時后，隨著作用濃度的增加，5637細胞遷移能力明顯下降，并呈顯著的濃度依賴性。
　　 2.小白菊內(nèi)酯(0.10μM)作用5637細胞48小時后，隨著作用濃度的增加，5637細胞侵襲能力明顯下降，并呈顯著的濃度依賴性。