二烯丙基三硫化物對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞體外作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要就以下幾部分展開(kāi)： 第一部分:二烯丙基三硫化物(DATS)對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響 目的：研究大蒜提取物二烯丙基三硫化物(DATS)于體外對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及其可能機(jī)制。 方法：采用MTT法觀察不同濃度的DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用不同時(shí)間(24，48和72h)后對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)應(yīng)用集落形成試驗(yàn)觀察不同濃度的DATS(0，0.5，1，5

2、，10，20和40μmol/L)對(duì)T24細(xì)胞集落形成的影響。T24細(xì)胞經(jīng)不同濃度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用24小時(shí)后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。并應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cde25C的表達(dá)，以觀察DATS對(duì)其的影響。 結(jié)果： 1.DATS對(duì)T24細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，MTT法顯示隨著藥物濃度升高(2.5～100μmol/L)和作用時(shí)間的延長(zhǎng)(24～

3、72h)其抑制作用逐漸增強(qiáng)，作用24h后，5～100μmol/L的抑制率范圍為13％81％，而作用48h及72h后抑制率范圍則分別升至250/～87％及31％-96％。呈明顯劑量和時(shí)間依賴性。 2.DATS抑制T24細(xì)胞集落形成，隨著濃度增高集落形成率逐步下降，濃度為20μmol/L時(shí)集落形成抑制率已達(dá)100％。 3.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，不同濃度DATS(10～40μmol/L)作用T24細(xì)胞24h后，G2/M期細(xì)胞逐漸增

4、多，表明DATS可引起G2/M期停滯，表現(xiàn)為劑量依賴性。 4.不同濃度DATS(10～80μmol/L)作用T24細(xì)胞24h后，Cdc25C蛋白表達(dá)隨藥物濃度增加逐漸降低。 結(jié)論： DATS能顯著抑制T24細(xì)胞增殖和集落形成，其抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。DATS能顯著抑制T24細(xì)胞中Cdc25C蛋白的表達(dá)，這可能是誘導(dǎo)T24細(xì)胞G2/M期停滯的分子機(jī)制之一。 第二部分:二烯丙基三硫化物(DATS)對(duì)人膀

5、胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響 目的：研究DATS在體外對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討其誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)信號(hào)通路等分子機(jī)制。 方法：研究DATS抗膀胱癌增殖作用是否為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所致。用光學(xué)顯微鏡及熒光染色形態(tài)學(xué)觀察經(jīng)DATS作用后T24細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡形態(tài)學(xué)改變。并應(yīng)用流式細(xì)胞儀(Annexin V/PI雙染法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。采用Western blotting方法檢測(cè)不同濃度DATS(10，20，40

6、，和80μmol/L)作用24小時(shí)后T24細(xì)胞中easpase-3、PARP等蛋白在誘導(dǎo)凋亡中的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)一步研究了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理，包括細(xì)胞中抗凋亡的P13K/Akt通路及Bcl-2家族蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.DATS作用于T24細(xì)胞后明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并呈顯著劑量依賴性。 2.光學(xué)顯微鏡顯示不同濃度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用于T24細(xì)胞24小時(shí)后使其細(xì)胞密度呈劑量依賴性降低。

7、同時(shí)觀察到凋亡細(xì)胞所具有的典型形態(tài)學(xué)改變。 3.流式細(xì)胞儀(Annexin V/PI雙染法)檢測(cè)不同濃度的DATS(10～80μmol/L)對(duì)T24細(xì)胞作用24h后細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性增加。細(xì)胞發(fā)生壞死比例為0.2％～1.3％，而發(fā)生凋亡的比例為6.2％～20.0％，較之對(duì)照組0.3％明顯為高，且呈劑量依賴性。其中早期凋亡細(xì)胞比例為4.8％～12.2％，晚期凋亡細(xì)胞比例為1.4％～7.8％，均較之對(duì)照組為高。 4.DAT

8、S作用于T24細(xì)胞后caspase-3和PARP均被激活，表現(xiàn)為procaspase-3的減少和裂解的PARP片段(89KD)出現(xiàn)，并呈顯著的劑量依賴性。 5.DATS作用于T24細(xì)胞后p-PDKl，p-Thr308-Akt，和p-Ser473-Akt的表達(dá)逐漸降低，呈劑量依賴性，但t-Akt的表達(dá)不受影響。 6.DATS作用于T24細(xì)胞后Bax和BAD表達(dá)逐漸增高，Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)逐漸降低，呈顯著的劑量依

9、賴性。而且Bax/Bcl-2的比例逐漸增高，呈顯著的劑量依賴性。 結(jié)論：DATS能誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡，凋亡的誘導(dǎo)作用呈顯著劑量依賴性。DATS誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡的機(jī)理可能通過(guò)抑制T24細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的激活從而調(diào)節(jié)Bcl-2家族等蛋白并最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。 第三部分:二烯丙基三硫化物(DATS)對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 目的：研究DATS于體外對(duì)人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其可能機(jī)制

10、。 方法：應(yīng)用MTT法檢測(cè)DATS對(duì)T24細(xì)胞粘附纖維連接蛋白(fibronectin)能力的影響，應(yīng)用Transwell小室進(jìn)行人工重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DATS對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響，并應(yīng)用劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)DATS對(duì)T24細(xì)胞遷移能力的影響。采用RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度DATS(10，20，40，和80μmol/L)作用24小時(shí)后的T24細(xì)胞中MMP-9 mRNA和MMP-2 mRNA的表達(dá)。采用Western bl

11、otting方法檢測(cè)不同濃度DATS(10，20，40，和80gμmol/L)作用24小時(shí)后的T24細(xì)胞中MMP-9蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.粘附試驗(yàn)表明DATS(10～80gμmol/L)作用24小時(shí)后，能有效抑制T24細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，且隨藥物濃度增高，抑制作用增強(qiáng)。 2.劃痕試驗(yàn)顯示DATS作用不同時(shí)間(0，12和24小時(shí))對(duì)T24細(xì)胞遷移力的影響隨濃度增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈劑量和時(shí)間依賴性。