SCF-c-Kit信號(hào)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲遷移的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、背景：膀胱癌的發(fā)生在惡性泌尿系腫瘤中較為多見(jiàn)，其高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。c-Kit是Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族的重要成員，在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，其與配體干細(xì)胞因子（SCF）結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、分化和遷移等過(guò)程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，SCF/c-Kit信號(hào)在胰腺癌、大腸癌和人類黑色素瘤等多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面具有重要作用，但具體的作用機(jī)制及其是否同樣在膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用的研究報(bào)道卻很少。文獻(xiàn)顯示，β-連環(huán)蛋白（β

2、-catenin）信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，其中β-catenin的胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移是該信號(hào)經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的標(biāo)志。最近的研究報(bào)道表明β-catenin信號(hào)也參與了膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此探討SCF/c-Kit信號(hào)在膀胱癌細(xì)胞侵襲遷移方面具有什么樣的作用及其與β-catenin信號(hào)之間有什么樣的關(guān)系，對(duì)全面了解膀胱癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要意義。
　　目的：探討SCF/c-Kit信號(hào)對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲遷移的影響

3、及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：⑴采用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)T24細(xì)胞c-Kit的表達(dá)。⑵通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)）觀察T24細(xì)胞在經(jīng)過(guò)SCF（1 ng/mL）刺激24h后，其遷移能力的變化。⑶收集經(jīng)過(guò)SCF（1 ng/mL）單獨(dú)刺激24h，或分別使用c-kit抑制劑Imatinib（100 nM）、PI3K-Akt信號(hào)通路特異性抑制劑Wortmannin（1μM）、MAPK激酶MEK的高效選擇性抑制劑U0

4、126（10μM）、STAT3通路特異性抑制劑JSI-124（5μM）和β-catenin信號(hào)抑制劑XAV-939（10 nM）預(yù)處理40min，再用SCF（1 ng/mL）刺激24h后的T24細(xì)胞，進(jìn)行 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)（直接與間接計(jì)數(shù)法），觀察T24細(xì)胞侵襲性的變化。⑷Western blot檢測(cè)T24細(xì)胞在SCF（1 ng/mL）單獨(dú)刺激或先使用PI3K-Akt信號(hào)通路特異性抑制劑Wortmannin（1μM）預(yù)處理40

5、 min，再用SCF（1 ng/mL）刺激后Akt磷酸化情況。⑸采用免疫熒光化學(xué)技術(shù)，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察 T24細(xì)胞經(jīng)過(guò) SCF（1ng/mL）刺激不同時(shí)間后，β-catenin在細(xì)胞中的定位及其動(dòng)態(tài)變化。⑹Western blot檢測(cè)T24細(xì)胞在使用GSK-3β抑制劑Staurosporine(5 nM)或LiCl(10 mM)處理24 h后，β-catenin總蛋白和胞漿蛋白的表達(dá)情況，以明確T24細(xì)胞中是否存在GSK-3β對(duì)

6、β-catenin的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：①T24細(xì)胞中存在c-Kit的表達(dá)，其中12％的T24細(xì)胞表面存在c-Kit受體的表達(dá)。②T24細(xì)胞經(jīng)SCF（1 ng/mL）作用24 h后，遷移能力（75.42%）與對(duì)照組相比（38.99%）明顯提高（P＜0.01）。③Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)（直接與間接計(jì)數(shù)法）的結(jié)果表明：與對(duì)照組（細(xì)胞數(shù)和OD值：26.25±0.96，0.096±0.004）相比，SCF單刺激組（細(xì)胞數(shù)和OD值：4

7、7.25±1.71，0.119±0.006）細(xì)胞侵襲能力明顯提高（P＜0.01）；Imatinib（100 nM）+SCF（1 ng/mL）組（細(xì)胞數(shù)和OD值：26.75±0.96，0.091±0.012）、Wortmannin（1μM）+SCF（1 ng/mL）組（26±2.16，0.096±0.004）和XAV-939（10 nM）+SCF（1 ng/mL）組（細(xì)胞數(shù)和OD值：26±0.82，0.103±0.002）與SCF單刺激組

8、相比侵襲能力則明顯降低（P＜0.01）；而U0126（10μM）+SCF（1 ng/mL）組（細(xì)胞數(shù)和OD值：46.75±2.63，0.115±0.002）和JSI-124（5μM）+SCF（1 ng/mL）組（細(xì)胞數(shù)和OD值：47.75±2.99，0.114±0.004）的細(xì)胞侵襲能力與SCF單刺激組相比并無(wú)明顯差異（P＞0.05）。④T24細(xì)胞經(jīng)SCF（1 ng/mL）刺激后，與對(duì)照組相比出現(xiàn)了明顯的磷酸化Akt條帶(P<0.01)

9、，而使用特異性抑制劑Wortmannin（1μM）預(yù)處理40 min后再用SCF（1 ng/mL）刺激的T24細(xì)胞磷酸化 Akt條帶與 SCF單刺激組相比明顯減弱(P<0.01)。⑤與對(duì)照組相比，T24細(xì)胞受SCF（1 ng/mL）刺激不同時(shí)間后，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的分布情況有所不同：對(duì)照組（SCF刺激0 h時(shí)），T24細(xì)胞膜表面均勻分布細(xì)小顆粒狀綠色熒光；SCF刺激30 min后，可見(jiàn)顆粒狀綠色熒光呈彌漫性分布于胞漿內(nèi)；SCF

10、刺激1 h后，可見(jiàn)胞核內(nèi)的綠色點(diǎn)狀熒光明顯增多，說(shuō)明隨著SCF刺激時(shí)間的變化，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin有從胞漿內(nèi)向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)。⑥運(yùn)用GSK-3β抑制劑Staurosporine(5 nM)、LiCl(10 mM)處理T24細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin總蛋白及胞漿蛋白的表達(dá)量均明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：⑴SCF/c-Kit信號(hào)通過(guò)啟動(dòng)下游的PI3K-Akt途徑促進(jìn)T24細(xì)胞的侵襲遷移；⑵SCF也可以通過(guò)激活