siRNA抑制Livin基因的表達(dá)對人膀胱癌EJ細(xì)胞生長及化療敏感性的影響.pdf

1、目的：Livin是IAP家族的最新成員。其在正常膀胱組織中不表達(dá)，而在人膀胱癌細(xì)胞中的高表達(dá)可刺激腫瘤細(xì)胞的增殖，并提高膀胱癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率，更能使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，其可成為膀胱癌的治療靶點(diǎn)及預(yù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測指標(biāo)。本研究通過觀察siRNA抑制人膀胱癌EJ細(xì)胞中Livin基因的表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響，為膀胱癌發(fā)病機(jī)制的研究，以及對膀胱癌的基因和化學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴觀察通過不同條

2、件轉(zhuǎn)染過的EJ細(xì)胞，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞條件的優(yōu)化及效率的評價(jià)。⑵采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將人工合成的特異性Livin siRNA轉(zhuǎn)入人膀胱癌EJ細(xì)胞中。⑶經(jīng)Livin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，半定量RT-PCR檢測各組EJ細(xì)胞中Livin mRNA的表達(dá)。⑷Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞中Livin蛋白的表達(dá)。⑸選用THP作用于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的

3、凋亡情況。
　　結(jié)果：①用FAM標(biāo)記的Negative control siRNA轉(zhuǎn)染6孔板中的人膀胱癌EJ細(xì)胞，觀察到當(dāng)細(xì)胞數(shù)量為3×i05/孔，siRNA為100pmol/孔、Lipofectamine(R)2000試劑為5μ l/孔時(shí)，有較高轉(zhuǎn)染效率(70％)。當(dāng)細(xì)胞密度為4×103/孔接種于96孔板中，siRNA為5pmol/孔、Lipofectamine(R)2000試劑為0.25μ l/孔時(shí)，有較高轉(zhuǎn)染效率(70％)；

4、② Livin特異性siRNA轉(zhuǎn)染人膀胱癌EJ細(xì)胞24h后，干擾組（轉(zhuǎn)染siRNA）中Livin mRNA的表達(dá)較空白對照組及陰性對照組顯著降低(P＜0.01)；③轉(zhuǎn)染48h后，Livin在蛋白水平的表達(dá)，較空白對照組及陰性對照組明顯下調(diào)(P＜0.01)；④經(jīng)CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，Livin siRNA干擾組、THP化療組及干擾+化療的聯(lián)合作用組均可抑制EJ細(xì)胞的增殖。且聯(lián)合作用組對細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于單獨(dú)干擾組及單獨(dú)化療作用組(P＜

5、0.01)；⑤流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，干擾組、化療組及聯(lián)合作用組均可促使膀胱癌EJ細(xì)胞的凋亡，且聯(lián)合作用組的細(xì)胞凋亡率顯著高于單獨(dú)干擾組及單獨(dú)化療作用組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：⑴Livin基因在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的促進(jìn)作用；⑵本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的Livin特異性siRNA能夠有效抑制人膀胱癌EJ細(xì)胞中Livin基因的表達(dá)；⑶通過抑制Livin基因的表達(dá)，可有效抑制人膀胱癌EJ細(xì)胞的增殖、并促進(jìn)其凋亡；