靶向Hsp90βsiRNA對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的：探討RNA干擾技術(shù)沉默Hsp90β（Heat shock protein90 beta）基因表達(dá)對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及化療敏感性的影響。
　　 方法：1.采用Real-Time PCR檢測(cè)Jurkat、Raji、K562、HL-60細(xì)胞株Hsp90βmRNA表達(dá)的情況，篩選出高表達(dá)Hsp90β的細(xì)胞株。2.針對(duì)Hsp90β基因全長(zhǎng)cDNA序列Hsp90B1（NM_003299.1），設(shè)計(jì)并構(gòu)建3對(duì)Hsp90β干

2、擾序列和一對(duì)隨機(jī)對(duì)照序列，分別克隆獲得質(zhì)粒pSOS-Hsp90βi1，pSOS-Hsp90βi2，pSOS-Hsp90βi3及pSOS-Hsp90βicontrol；應(yīng)用LipofectamineTM LTX將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Hsp90β的細(xì)胞中，Real-Time PCR檢測(cè)Hsp90βmRNA水平的變化，篩選出沉默效果最好的Hsp90βsiRNA干擾片段；Western印跡法檢測(cè)Hsp90β蛋白表達(dá)水平。3.MTT法和流式細(xì)胞儀

3、檢測(cè)Hsp90psiRNA對(duì)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。4.檢測(cè)Hsp90βsiRNA對(duì)Jurkat細(xì)胞化療敏感性的影響，選不同濃度的長(zhǎng)春新堿、阿霉素和依托泊苷，通過(guò)MTT法抗癌藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)干擾前后對(duì)Jurakt細(xì)胞化療敏感性的變化。
　　 結(jié)果：1.Real-Time PCR結(jié)果顯示Hsp90β在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于其它三株白血病細(xì)胞株（Raji，K562，HL-60），表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4、2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建Hsp90β基因條特異性真核載體pSOS-Hsp90βi1、2、3并分別轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明顯，Jurkat細(xì)胞Hsp90βmRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。3.Hsp90β基因表達(dá)沉默后，Jurkat細(xì)胞增殖明顯受抑，細(xì)胞凋亡率比空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染pSOS-Hsp90βicontrol組明顯增加，差異具有顯著意義（P<0.05）。4.轉(zhuǎn)染了pSOS-

5、Hsp90βi2的Jurkat細(xì)胞對(duì)VCR、ADM和VP16藥物的IC50顯著低于其余兩組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：不同的白血病細(xì)胞株Hsp90β的表達(dá)存在差異，在Jurkat、Raji、K562、HL-60中Jurkat細(xì)胞表達(dá)Hsp90β最高；成功構(gòu)建了3種真核表達(dá)載體pSOS-Hsp90βsiRNA，并篩選出沉默效果最好的pSOS-Hsp90βi2；靶向pSOS-Hsp90βi2可下調(diào)Hsp90β表達(dá)，對(duì)人白血病Ju