重組人p53腺病毒對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前rAd-p53的臨床應(yīng)用主要集中在頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌等，涉及到胃癌的治療研究很少。順鉑、紫杉醇是臨床胃癌化療方案中常用藥物，藥物的耐藥性是限制其臨床應(yīng)用的一個(gè)主要原因。本研究的目的是研究重組人p53腺病毒感染不同p53狀態(tài)胃癌細(xì)胞，觀察外源p53基因在胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞周期阻滯與凋亡的影響，以及對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的作用和機(jī)制。為開(kāi)辟新的胃癌治療途徑，更好的使用rAd-p53治療胃癌，提高胃癌的臨床療效尤其是rAd-

2、p53與化療藥物的科學(xué)聯(lián)合應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法： 1.細(xì)胞選用三種攜帶不同p53狀態(tài)人胃癌細(xì)胞系BGC-823：即含野生型p53基因的細(xì)胞(略寫(xiě)為W)、含突變型p53基因的細(xì)胞(略寫(xiě)為M).含空載質(zhì)粒即p53基因缺失的細(xì)胞(略寫(xiě)為neo)。 2.實(shí)驗(yàn)藥物選用 rAd-p53 (recombinant adenovirus-p53 rAd-p53)、順鉑(cis-dismine dichoropla

3、tinum，DDP)，紫杉醇(paclitaxel，TAX)。 3.MTI比色法測(cè)定不同濃度的單藥及聯(lián)合用藥作用細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，并繪制生長(zhǎng)曲線。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期分布和凋亡率。 5.免疫細(xì)胞化學(xué)與Western blotting法檢測(cè)感染rAd-p53細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，計(jì)量資料滿足正態(tài)性，方差齊時(shí)多組

4、均數(shù)間比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD方法；每組處理前后的比較用配對(duì)t檢驗(yàn)；P≤0.05具顯著性。 結(jié)果： 1.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)顯示：5×10<'7>VP/ml rAd-p53感染三種胃癌細(xì)胞48h后，p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)于瘤細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。neo對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)p53表達(dá)，而W和M對(duì)照組細(xì)胞則呈弱陽(yáng)性表達(dá)。tAd-p53作用W細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組p53的蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(50

5、.20±4.84)％顯著高于對(duì)照組(14.15±3.44)％(P<0.001)；rAd-p53作用M細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組p53的蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(63.74±4.21)％顯著高于對(duì)照組(30.80±5.32)％(P<0.001)；rAd-p53作用neo細(xì)胞前未見(jiàn)p53表達(dá)，rAd-p53作用neo細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組p53的蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(48.87±5.88)％。 2.Western Blotting結(jié)果顯示：5×10<'

6、7>VP/ml rAd-p53感染三種胃癌細(xì)胞48h后在53KD位置上均有一條清晰的雜交帶，對(duì)照組neo細(xì)胞在同一位置無(wú)雜交帶，而對(duì)照組wW胞和M細(xì)胞則在53KD處有很淺的一條雜交帶。 3.不同濃度的rAd-p53、DDP、TAX單藥作用48h后，三種胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間及不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間OD值比較(P<0.01)。結(jié)果顯示，三種藥物均可有效抑制三種胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)。其抑制效應(yīng)呈劑

7、量依賴性。rAd-p53對(duì)BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與細(xì)胞內(nèi)在的p53狀態(tài)無(wú)關(guān)。DDP、TAX同濃度組作用三種不同p53狀態(tài)的BGC-823細(xì)胞比較，作用于W細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率高于M與neo細(xì)胞(P<0.01)，M與neo細(xì)胞比較P>0.05。M與neo較W細(xì)胞IC<,50>(median inhibitingconcentration,半數(shù)抑制濃度)值增高。 4.不同濃度的rAd-p53、DDP、TAX聯(lián)合用藥作用于三種胃癌細(xì)

8、胞，所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間及各實(shí)驗(yàn)組之間OD值比較(P<0.01)。rAd-p53+DDP與rAd-p53+TAX對(duì)M細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率高于W與neo細(xì)胞(P<0.01)，W與neo細(xì)胞比較P>0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rAd-p53與DDP、TAX聯(lián)合用藥，均可有效抑制三種胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),呈劑量依賴性。rAd-p53感染三種胃癌細(xì)胞48h后聯(lián)合DDP、Tax用藥較DDP、TAX單藥對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增高(P<0.01)，DDP、TAX的IC<

9、,50>值下降。 5.根據(jù)MTT結(jié)果繪制rAd-p53與DDP、TAX單用和聯(lián)合對(duì)三種胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)曲線：不同濃度的rAd-p53與DDP、TAX單用和聯(lián)合作用三種不同p53狀態(tài)的胃癌細(xì)胞24、48、72h的體外生長(zhǎng)抑制曲線表明對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用均呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性效應(yīng)。 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAd-p53與DDP、TAX單用和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)三種胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞周期變化與凋亡效應(yīng)： 6.

10、1 對(duì)于W細(xì)胞，與空白對(duì)照組比：?jiǎn)渭價(jià)Ad-p53作用出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為9.33％±1.27％；單純加DDP出現(xiàn)以G<,1>期為主的阻滯，凋亡率為30.8％±1.53％；單純加TAX出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為33.5％±2.05％；rAd-p53+DDP發(fā)生G<,2>/M期阻滯，凋亡率為47.7％±1.66％；rAd-p53+TAX發(fā)生更明顯G<,2>/M期阻滯，凋亡率為52.8％±2.35％；以凋亡作為

11、化療增效效應(yīng)，rAd-p53+DDP的增效比為1.55，rAd-p53+TAX的增效比為1.58。 6.2.對(duì)于M細(xì)胞，單純r(jià)Ad-p53作用出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為11.76％±2.33％；單純加DDP出現(xiàn)以G<,1>期為主的阻滯，凋亡率為24.7％±2.42％；單純加TAX出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為29.89％±1.9％；rAd-p53+DDP發(fā)生G<,2>/M期阻滯，凋亡率為51.88％+2.03％；rA

12、d-p53+TAX發(fā)生更明顯G<,2>/M期阻滯，凋亡率為60.2％±2.33％；以凋亡作為化療增效效應(yīng)，rAd-p53+DDP的增效比為2.1，rAd-p53+TAX的增效比為2.01。 6.3.對(duì)于neo細(xì)胞，單純r(jià)Ad-p53作用出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為10.97％±1.5％；單純加DDP出現(xiàn)以G<,1>期為主的阻滯，凋亡率為23.2％±1.58％；單純加TAX出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為26.8％

13、±1.47％；rAd-p53+DDP發(fā)生G<,2>/M期阻滯，凋亡率為44.3％±2.26％；rAd-p53+TAX發(fā)生更明顯G<,2>/M期阻滯，凋亡率為50.53％±2.28‰以凋亡作為化療增效效應(yīng)，rAd-p53+DDP的增效比為1.91，rAd-p53+TAX的增效比為1.89。 7.rAd-p53單藥感染三種細(xì)胞24、48h分別進(jìn)行caspase-3蛋白表達(dá)定量分析，以公式熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的相對(duì)含量。FI>1.

14、0為陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達(dá)。結(jié)果顯示：對(duì)照組W、M細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)，neo細(xì)胞呈陰性表達(dá)。rAd-p53感染三種細(xì)胞24、48hcaspase-3蛋白表達(dá)有時(shí)間依賴性。三細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組之間比較P<0.01。同時(shí)間組caspase-3蛋白表達(dá)比較P>0.05。 結(jié)論： 1.rAd-p53可抑制三種不同p53狀態(tài)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該作用不受內(nèi)源性p53狀態(tài)的影響。rAd-p53對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑

15、制作用呈劑量時(shí)間依賴性效應(yīng)，并使細(xì)胞周期阻滯于G<,2>/M期。 2.rAd-p53感染三種胃癌細(xì)胞48h后實(shí)驗(yàn)組三細(xì)胞均有p53蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組W、M細(xì)胞有弱陽(yáng)性表達(dá)，neo細(xì)胞p53蛋白表達(dá)陰性；rAd-p53可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)。 3.rAd-p53聯(lián)合TAX、DDP可抑制三種胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制作用較單藥時(shí)增加。聯(lián)合作用時(shí)化療藥物IC50值較單藥下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率增高，細(xì)胞的周期分