P53 binding protein1調(diào)控乳腺癌進展轉(zhuǎn)移及化療敏感性的機制研究.pdf

1、研究目的:
　　乳腺癌是嚴重威脅女性生命健康的最常見惡性腫瘤之一。全球乳腺癌的發(fā)病率以每年0.2～8％的幅度上升，每年約有140萬人被診斷為乳腺癌，約50萬人死于乳腺癌。我國流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年遞增的趨勢，并且發(fā)病年齡趨向于年輕化。乳腺癌的生存率與臨床分期密切相關(guān)，遠處轉(zhuǎn)移往往是乳腺癌的致死因素。Macià等研究顯示乳腺癌的5年生存率為83.3％，其中Ⅰ期患者5年生存率達97.1％，而Ⅳ期患者僅為2

2、4.5％。乳腺癌的發(fā)生和進展過程中往往伴隨著一系列原癌基因的激活及抑癌基因的失活，這些分子生物學(xué)的異常決定著腫瘤的特征，也是其臨床進展行為的基礎(chǔ)。越來越多的基因已被證實與乳腺癌的進展轉(zhuǎn)移相關(guān)，如人類表皮生長因子受體2（Her-2）、Metadherin(MTDH)等原癌基因以及P53、BRCA1等抑癌基因，并且部分基因已經(jīng)作為分子靶向治療的位點應(yīng)用到乳腺癌的臨床治療中。因此，發(fā)現(xiàn)決定乳腺癌進展轉(zhuǎn)移和化療耐藥的關(guān)鍵基因?qū)⒂兄趶姆肿铀缴?/p>

3、認識乳腺癌，并對其早期診斷和分子靶向治療的新藥研發(fā)具有極其重要的意義。
　　P53bindingprotein1(53BP1)是DNA損傷信號傳導(dǎo)通路中的重要基因，53BP1缺失的細胞對DNA損傷敏感，其缺失可以增強放療敏感性已經(jīng)被充分證實。在導(dǎo)師與國際多家研究機構(gòu)的研究中，通過分析了176例乳腺癌患者53BP1基因rs560191位點單核苷酸多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)rs560191位點GG基因型與局部高復(fù)發(fā)率密切相關(guān);通過對504例平均有7

4、.5年隨訪結(jié)果的乳腺癌組織芯片進行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，約15％的患者表現(xiàn)為53BP1蛋白缺失，而且其缺失與遠處轉(zhuǎn)移高風(fēng)險密切相關(guān)。我們這些前期結(jié)果均支持53BP1是乳腺癌中一個有重要功能的抑癌基因，但其在乳腺癌中的作用卻知之甚少。
　　研究方法及結(jié)果:
　　在本課題中，我們擬進一步深入研究53BP1基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，具體內(nèi)容包括以下三個部分:
　　第一部分53BP1調(diào)控乳腺癌進展轉(zhuǎn)移的機制研究
　　

5、研究方法:為了驗證53BP1的在乳腺癌進展轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先借助WesternBlot技術(shù)檢測了39對新鮮乳腺癌組織及其配對的癌旁正常乳腺組織中53BP1的表達情況，并對316例乳腺癌發(fā)生過程中（乳腺正常組織→不典型增生→原位癌→浸潤癌）53BP1的表達量進行免疫組織化學(xué)染色，從而驗證53BP1在乳腺癌的發(fā)生過程中起到重要的作用。
　　隨后我們設(shè)計了針對53BP1的3個干擾序列，并將其連接到干擾載體pGPU6-Neo-GFP上

6、，然后通過公司測序驗證干擾載體的成功構(gòu)建。53BP1的過表達載體N-Myc-53BP1WTpLPC-Puro為美國洛克菲勒大學(xué)TitiadeLange教授贈與。我們將53BP1的干擾載體(shRNA)和過表達載體（53BP1-OVE）及對照載體(Control)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7等，分別加入G418和嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定干擾和過表達53BP1及對應(yīng)的對照組細胞系，并用Real-timeP

7、CR和WesternBlot驗證53BP1干擾和過表達的效果。
　　為了檢測53BP1對乳腺癌增殖和浸潤轉(zhuǎn)移的影響，我們首先用MTT和平板克隆形成的方法分別檢測干擾53BP1對MCF-7和T47D、過表達53BP1對MDA-MB-231和MDA-MB-468的增殖和克隆形成的影響，接著用Transwell實驗檢測53BP1對乳腺癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移能力的影響。為了闡明其具體的分子機制，我們將轉(zhuǎn)染53BP1前后的細胞系，送全基因組mic

8、roRNA表達譜芯片，篩選出變化最顯著的microRNA-146a。通過文獻檢索和借助miRbase、PicTar和TargetScan等數(shù)據(jù)庫預(yù)測microRNA-146a的靶基因為p65，進一步用WesternBlot檢測53BP1干擾或過表達前后對NF-kappaB通路的影響。隨后對過表達53BP1的MDA-MB-231細胞進行microRNA-146asiRNA的轉(zhuǎn)染，觀察NF-kappaB通路的變化，并分析53BP1對增殖和浸

9、潤轉(zhuǎn)移的影響。為了進一步證實53BP1對乳腺癌增殖和浸潤轉(zhuǎn)移的影響，我們通過裸鼠皮下成瘤模型，觀察過表達53BP1前后對裸鼠皮下成瘤能力和生長速度的影響，并對皮下成瘤的組織應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和WesternBlot檢測NF-kappaB通路的變化;通過尾靜脈注射的肺轉(zhuǎn)移模型觀察過表達53BP1前后對肺轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　研究結(jié)果:臨床研究中，我們通過WesternBlot檢測新鮮乳腺癌組織及其配對的癌旁正常乳腺組織中53BP1

10、的表達，發(fā)現(xiàn)53BP1在癌組織中的表達量明顯低于其配對的正常組織。通過對316例乳腺癌不同發(fā)生階段中的組織進行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示53BP1在96.00％的正常乳腺(Normal)組織中表達(48/50，)、在乳腺普通增生(UDH)的組織中表達率也高達90.32％(28/31)、在乳腺不典型增生(ADH)的組織中表達率為64.71％(11/17)、在導(dǎo)管內(nèi)原位癌(DCIS)組織中的表達率僅為45％(9/29)、而在浸潤性導(dǎo)管癌(C

11、ancer)的組織中53BP1的表達率僅為16.40％(31/189)(p＜0.05)。
　　細胞學(xué)實驗中，我們經(jīng)測序驗證53BP1的干擾載體pGPU6-Neo-GFP53BP1shRNA和過表達載體N-Myc-53BP1WTpLPC-Puro的正確性，并在乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468中轉(zhuǎn)染過表達載體，并標(biāo)記為53BP1-OVE;在MCF-7和T47D細胞中轉(zhuǎn)染干擾載體并標(biāo)記為shRNA，并通過Realt

12、imePCR和WesternBlot驗證了53BP1的干擾或過表達效果良好，可進行下一步實驗。
　　首先我們檢測了53BP1對乳腺癌增殖和浸潤轉(zhuǎn)移的影響。MTT和平板克隆形成顯示干擾53BP1的MCF-7和T47D細胞增殖速度加快(MCF-7，P=0.048;T47D，P=0.073)、克隆形成能力明顯增強(MCF-7，P=0.007;T47D，P=0.008)，過表達53BP1的MDA-MB-231和MDA-MB-468的增殖速

13、度明顯降低（MDA-MB-231，P=0.089;MDA-MB-468，P=0.061）、克隆形成能力明顯下降（MDA-MB-231，P=0.006;MDA-MB-468，P=0.002）。Transwell結(jié)果顯示干擾53BP1的MCF-7和T47D細胞的侵襲和遷移能力明顯降低、過表達53BP1的MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的侵襲和遷移能力增強（P均小于0.0001）。為了研究其具體的分子機制，通過對53BP1干擾和

14、過表達前后的細胞送全基因組microRNA表達譜芯片和Real-timePCR驗證，顯示microRNA-146a為變化最顯著的microRNA。我們通過WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)53BP1干擾后可激活NF-kappaB通路，誘導(dǎo)P65的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，而過表達53BP1后則抑制了此通路。隨后我們對過表達53BP1的MDA-MB-231細胞進行microRNA-146asiRNA的轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)53BP1對NF-kappaB通路的抑

15、制作用，并能逆轉(zhuǎn)53BP1對增殖和浸潤轉(zhuǎn)移的影響。通過裸鼠皮下成瘤觀察干擾或過表達53BP1前后對裸鼠皮下成瘤能力和生長速度的影響，我們發(fā)現(xiàn)過表達53BP1后能明顯抑制腫瘤的成瘤能力和生長速速(P＜0.001)，并且與對照組相比，過表達53BP1的腫瘤邊界比較清晰，這提示過表達53BP1能抑制腫瘤的侵襲能力;通過對皮下成瘤的組織用免疫組織化學(xué)染色和WesternBlot檢測NF-kappaB通路的變化，也進一步驗證了體外細胞學(xué)實驗結(jié)果。

16、通過對尾靜脈注射的肺轉(zhuǎn)移模型觀察過表達53BP1前后對肺轉(zhuǎn)移能力的影響，我們發(fā)現(xiàn)注射對照組及過表達53BP1的MDA-MB-231細胞5周后，對照組的11只裸鼠的肺組織肉眼和顯微鏡下均能發(fā)現(xiàn)明顯的較大轉(zhuǎn)移灶，而過表達53BP1組的僅在顯微鏡下能看到較小的轉(zhuǎn)移灶。
　　第二部分53BP1抑制乳腺癌血管形成的機制研究
　　研究方法:為了檢測53BP1對乳腺癌血管新生的影響，我們通過收集正常傳代培養(yǎng)的干擾或過表達53BP1的乳腺癌

17、細胞的上清，分別通過毛細血管形成實驗作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞觀察53BP1對小管形成能力的影響;通過雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗觀察對血管新生的能力的影響;通過主動脈環(huán)實驗作用于小鼠主動脈環(huán)觀察新生血管數(shù)目的變化。并選取83例乳腺癌組織進行新生血管標(biāo)記物CD31、MMP-2和MMP-9免疫組化染色分析53BP1在臨床乳腺癌組織中與血管形成的關(guān)系。為了闡明53BP1影響血管新生的機制，在干擾53BP1的MCF-7細胞中應(yīng)用Akt的siRNA

18、后，通過小管形成實驗、主動脈環(huán)實驗和CAM實驗驗證Akt是否參與了53BP1影響乳腺癌血管新生的影響。并通過對裸鼠皮下成瘤的組織進行CD31的免疫組織化學(xué)染色體內(nèi)驗證53BP1對血管形成的影響。
　　研究結(jié)果:通過細胞學(xué)實驗，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細胞能明顯增加其小管形成能力，而過表達53BP1的MDA-MB-231細胞明顯抑制其成管能力（MCF-7，P=0.026;MDA-MB-231，P=0.004）。通過雞胚絨毛

19、尿囊膜(CAM)實驗，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細胞能明顯增加血管新生能力，而過表達53BP1的MDA-MB-231細胞明顯抑制其能力（MCF-7，P=0.025;MDA-MB-231，P=0.006）。通過主動脈環(huán)實驗作用于小鼠主動脈環(huán)觀察新生血管分支變化，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細胞能明顯增加新生血管分支的形成而過表達53BP1的MDA-MB-231細胞明顯抑制新生血管分支的形成能力（MCF-7，P=0.002;M

20、DA-MB-231，P=0.008）。為了闡明53BP1影響血管新生的機制，我們用WesternBlot篩選出Akt通路，并在干擾53BP1的MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染AktsiRNA后，通過小管形成實驗、主動脈環(huán)實驗和CAM實驗發(fā)現(xiàn)Akt降低后可逆轉(zhuǎn)干擾53BP1后對乳腺癌血管新生的促進作用。我們進一步借助體內(nèi)實驗驗證53BP1對血管新生的影響，通過對裸鼠皮下成瘤的組織進行CD31的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)干擾53BP1的MCF-7細胞形成的

21、腫瘤中微血管密度的標(biāo)記物CD31數(shù)量明顯增多(11.2±4.3vs.27.3±5.9;P＜0.001)而過表達53BP1的MDA-MB-231細胞形成的腫瘤中CD31數(shù)量減少(21.4±7.8vs.5.1±3.7;P＜0.001)。臨床研究中我們通過選取83例乳腺癌組織進行新生血管標(biāo)記物CD31、MMP-2和MMP-9免疫組化染色，結(jié)果顯示53BP1的高表達與CD31、MMP-2、MMP-9的低表達密切相關(guān)(P=0.012、P=0.03

22、7、P=0.003)，這進一步證實了53BP1對血管新生的影響。
　　第三部分53BP1增強乳腺癌對5-氟尿嘧啶敏感性的機制研究
　　研究方法:為了檢測53BP1對乳腺癌化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性的影響，我們首先用MTT檢測了不同乳腺癌細胞中53BP1的表達量與5-Fu的敏感性的關(guān)系，用免疫熒光法檢測了5-Fu處理各個乳腺癌細胞系后53BP1和H2AX的定位。接下來用流式細胞術(shù)檢測了5-Fu處理53BP1干擾或

23、過表達前后對細胞周期的影響，用WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白Akt、Bcl-2、Bax、P21的變化。為了探討53BP1影響5-Fu的作用機制，我們檢測了轉(zhuǎn)染前后胸苷酸合成酶(TS)和二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)的變化，并在干擾53BP1的MCF-7細胞中用TS和DPYD的siRNA驗證53BP1對5-Fu的影響。同時通過裸鼠皮下成瘤模型，對單獨或同時轉(zhuǎn)染53BP1和應(yīng)用5-Fu處理后裸鼠成瘤能力和腫瘤生長速度的影響，并對成瘤的組

24、織用TUNEL法檢測細胞的凋亡情況進一步驗證細胞學(xué)實驗結(jié)果。
　　研究結(jié)果:通過MTT檢測顯示乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和T47D中53BP1的表達量越高，其對5-Fu的反應(yīng)越敏感，通過用免疫熒光法檢測5-Fu處理乳腺癌細胞系后53BP1和H2AX的定位也證實了此結(jié)果。通過對干擾或過表達53BP1的細胞用MTT檢測其對5-Fu的敏感性，我們發(fā)現(xiàn)過表達53BP1可以增強乳腺癌細胞對5-Fu的敏感

25、性，而干擾53BP1的細胞則表現(xiàn)出對5-Fu的耐藥性。接下來用流式細胞術(shù)檢測53BP1干擾或過表達前后細胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)53BP1可誘導(dǎo)G2/M期的阻滯，用WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示53BP1可增強促凋亡蛋白Bax和P21、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。通過WesternBlot檢測顯示干擾53BP1后TS和DPYD升高而過表達53BP1后二者均降低。通過在干擾53BP1的MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染TS和DPYD的si

26、RNA發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)干擾53BP1后對5-Fu的耐藥性。體內(nèi)試驗，通過裸鼠皮下成瘤模型，對單獨轉(zhuǎn)染53BP1和同時應(yīng)用5-Fu處理后裸鼠成瘤能力和腫瘤生長速度的影響，我們發(fā)現(xiàn)干擾53BP1后的腫瘤呈現(xiàn)出對5-Fu的耐藥性，而過表達53BP1的腫瘤能明顯增強5-Fu對腫瘤的抑制作用，并且聯(lián)合應(yīng)用過表達53BP1和5-Fu后要明顯優(yōu)于過表達53BP1或者5-Fu的單一作用。體內(nèi)試驗通過對皮下成瘤的組織用TUNEL法檢測細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)5

27、3BP1過表達的并用5-Fu處理的MDA-MB-231形成的腫瘤中細胞凋亡明顯多于對照組，干擾了53BP1的MCF-7且用5-Fu處理的腫瘤中凋亡的細胞數(shù)明顯少于對照組。這進一步證實了干擾53BP1能抑制5-Fu誘導(dǎo)的凋亡而過表達53BP1能增強5-Fu誘導(dǎo)的凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.細胞學(xué)實驗證實了53BP1對乳腺癌增殖、浸潤轉(zhuǎn)移、血管新生的抑制作用及增強化療敏感性功能。
　　2.動物實驗進一步證明53BP1對乳腺

28、癌增殖、浸潤轉(zhuǎn)移、血管新生的抑制作用及增強化療敏感性功能。
　　3.體內(nèi)外實驗闡明53BP1可通過microRNA介導(dǎo)的NF-kappaB通路影響乳腺癌的增殖和浸潤轉(zhuǎn)移能力;通過Akt影響血管新生的能力;通過TS和DPYD影響對化療藥物5-Fu的敏感性。
　　4.臨床研究驗證體內(nèi)外實驗所見，進一步支持了53BP1是一個多功能的抑癌基因。
　　意義:
　　1.揭示了53BP1抑制乳腺癌增殖、浸潤轉(zhuǎn)移及血管新生的作用