2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  研究整合素連接激酶(ILK)與核糖核酸酶抑制因子(RI)蛋白的相互作用,探討兩者相互作用對膀胱癌EJ細胞的ILK信號通路及EMT影響的分子機制。
  方法:
  1.根據(jù)ILK基因序列設(shè)計引物,經(jīng)PCR法擴增獲得ILK基因片段后,分別連接到真核表達載體 pEYFP-N1和 pCMV-3xflag-CMVTM-10上。通過酶切和DNA測序鑒定載體,并分別命名為pEYFP-N1-ILK and pCMV-3×F

2、lag-ILK。將pCMV-3×Flag-ILK載體和對照空白載體,以及LV5-RNH1和 LV5NC分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 EJ細胞株,命名為 EJ-ILK, EJ-FLAG,EJ-RI和 EJ-LV5,經(jīng) Western blot和細胞免疫熒光檢測蛋白過表達情況。
  2.在EJ和HEK293細胞內(nèi)進行ILK與RI的免疫共沉淀實驗,熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗和免疫熒光共定位實驗,用以研究體內(nèi)的相互作用。在細胞外應(yīng)用GST pulldown實驗

3、研究ILK與RI在體外的相互作用。
  3.CCK8檢測各組細胞增殖能力;流式細胞術(shù)檢測細胞周期;細胞免疫熒光檢測蛋白RI,ILK,p-Akt和p-GSK3β表達水平;小管形成實驗檢測ILK和RI相互作用對體外血管生成的影響。
  3.收集的穩(wěn)定表達細胞株EJ-ILK,EJ-FLAG,EJ-RI,EJ-LV5和EJ,用Western blot檢測ILK與RI相互作用對EJ細胞EMT及ILK信號通路的影響。
  5.構(gòu)建

4、BALB/C裸鼠移植瘤模型,觀察移植瘤生長,腫瘤微血管生長以及肺轉(zhuǎn)移情況;應(yīng)用免疫組化和組織免疫熒光檢測腫瘤組織中EMT相關(guān)蛋白及ILK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平。另外,在臨床人膀胱癌及癌旁組織標(biāo)本中同時檢測了ILK及RI蛋白的表達。
  結(jié)果:
  1.測序結(jié)果顯示:重組真核表達質(zhì)粒 pEYFP-N1-ILK和pCMV-3×flag-ILK構(gòu)建正確。細胞免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示ILK和RI在EJ細胞中成功

5、過表達。
  2.實驗結(jié)果顯示: ILK與RI在體內(nèi)和體外均存在相互作用。
  4.CCK8結(jié)果顯示EJ-ILK細胞增值能力較對照組明顯增強,而EJ-RI細胞則明顯減弱;流式細胞分析結(jié)果表明EJ-RI細胞與對照組相比,明顯阻滯于S期;小管形成實驗提示RI和EJ相互作用能夠抑制體外血管的形成。
  3.通過檢測各組穩(wěn)定表達細胞株,顯示EMT相關(guān)蛋白和ILK信號通路的一些關(guān)鍵靶蛋白呈現(xiàn)顯著的變化。
  5.BALB/

6、C裸鼠注射各組細胞后,與2個對照組相比,EJ-ILK組瘤重明顯增加;而EJ-RI組與對照組比較,瘤重明顯降低。組織免疫熒光和HE染色結(jié)果提示EJ-ILK組微血管明顯增加,EJ-RI組則明顯減少。肺組織HE染色實驗表明,EJ-ILK組有明顯肺轉(zhuǎn)移,而EJ-RI組未見明顯轉(zhuǎn)移。免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測結(jié)果顯示:EJ-ILK組中EMT及ILK信號通路蛋白變化明顯;EJ-RI組中EMT相關(guān)蛋白和ILK通路關(guān)鍵蛋白與對照組比較有顯著變化,且與E

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