ILK調(diào)控細(xì)胞間通訊蛋白參與腎臟衰老的機(jī)制研究.pdf

1、目的：腎臟是衰老較快的器官，腎臟衰老的主要病理特點是腎小球局灶硬化、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和炎細(xì)胞浸潤。本實驗室的早期研究發(fā)現(xiàn)，ILK可以加速腎臟衰老和纖維化過程，然而ILK促進(jìn)腎纖維化進(jìn)而參與腎臟衰老的機(jī)制目前尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)ILK的活化可下調(diào)腸、乳腺和腎小管上皮細(xì)胞E-cadlaerin的表達(dá)，而E-cadherin則在某些組織中參與細(xì)胞間連接的調(diào)控。晚近有研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1可通過connexin43促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞向纖維母

2、細(xì)胞分化，因此我們假設(shè)ILK參與腎纖維化和腎臟衰老的過程可能是通過調(diào)控細(xì)胞間通訊實現(xiàn)的。
　　 由于connexin43是腎臟細(xì)胞最重要的細(xì)胞間連接蛋白，因此本研究首先觀察人血漿ILK水平和大鼠腎組織ILK、connexin3表達(dá)隨增齡的變化；然后觀察正反義轉(zhuǎn)染ILK基因?qū)ο的ぜ?xì)胞connexin43表達(dá)的影響；并分別應(yīng)用AKT、GSK3的特異性抑制劑LY294002、SB415286抑制系膜細(xì)胞AKT和GSK3磷酸化，觀察其對

3、connexin43表達(dá)影響，進(jìn)一步探討ILK調(diào)控connexin43參與腎臟衰老的機(jī)制。
　　 方法：(1)采用整群隨機(jī)抽樣的方法，抽取80例健康北京社區(qū)居民，其中老年組62例，年齡68.36±6.16歲，青年組18例，年齡21.57±2.92歲。ELISA法檢測血漿中ILK含量.青年組和老年組ILK水平的比較應(yīng)用t檢驗，采用pearson相關(guān)和多元線性回歸分析影響老年組ILK水平的因素。(2)留取3月齡、24月齡Wistar

4、大鼠(n=6)腎組織和血清標(biāo)本，檢測血肌酐，尿素氮，石蠟切片行PAS染色，間接免疫熒光法檢測腎組織ILK、connexin43表達(dá)，RT-PCR、Western Blot法檢測腎組織內(nèi)ILK、connexin43、FN，COL IV表達(dá)。(3)將ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠腎小球系膜細(xì)胞中，G418篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)的ILK陽性系膜細(xì)胞，并應(yīng)用ILK SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞，觀察上調(diào)和下調(diào)ILK基因表達(dá)對系膜細(xì)胞connexin表達(dá)的影響；

5、應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測上調(diào)ILK基因?qū)ο的ぜ?xì)胞FN，COL IV，P16、P21表達(dá)的影響；分別提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白，觀察上調(diào)ILK基因?qū)ο的ぜ?xì)胞胞漿和胞核AKT、磷酸化AKT表達(dá)的影響。應(yīng)用LY294002，SB415286抑制正常系膜細(xì)胞AKT和GSK3磷酸化，觀察對connexin43表達(dá)的影響；并抑制ILK陽性系膜細(xì)胞AKT磷酸化，觀察ILK抑制connexin43表達(dá)是否經(jīng)由AKT途徑。
　　

6、 結(jié)果：(1)北京社區(qū)健康人群老年組血漿ILK水平高于青年組(p<0.01)，老年組ILK水平和年齡正相關(guān)(r=0.417，p<0.05)，多元回歸分析顯示年齡是影響血漿ILK水平的獨立危險因素。(2)24月齡大鼠體重、腎重、相對腎重、血肌酐、尿素氮水平均高于3月齡組(p<0.05，p<0.01)，PAS染色顯示24月齡大鼠出現(xiàn)腎小球局灶硬化，局灶腎小管萎縮，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤；RT-PCR、Western blot顯示腎組織內(nèi)FN、COL

7、 IV表達(dá)升高(p<0.05)，ILK表達(dá)升高(p<0.05，p<0.01)和connexin43表達(dá)下降(p<0.05，p<0.01)。(3)體外研究顯示ILK過表達(dá)可導(dǎo)致系膜細(xì)胞connexin43表達(dá)降低(p<0.05)，下調(diào)ILK表達(dá)則觀察到相反結(jié)果(p<0.05，p<0.01)；ILK過表達(dá)還可導(dǎo)致系膜細(xì)胞胞漿和胞核磷酸化AKT表達(dá)升高(p<0.01)、磷酸化GSK3表達(dá)升高(p<0.01)、細(xì)胞增殖能力降低以及SA-βgal

8、陽性細(xì)胞增多；抑制AKT的磷酸化后正常系膜細(xì)胞connexin43表達(dá)升高(p<0.05)，而抑制GSK3磷酸化則無上述作用；應(yīng)用LY294002抑制ILK陽性系膜細(xì)胞AKT的磷酸化則可以觀察到ILK對connexin43的負(fù)向調(diào)控作用減弱。
　　 結(jié)論：人血漿ILK水平隨增齡升高，年齡是ILK升高的獨立危險因素，提示ILK可作為評價人群自然衰老的指標(biāo)。老年大鼠腎組織ILK表達(dá)升高和connexin43表達(dá)的降低，并出現(xiàn)FN、C