間充質(zhì)干細胞調(diào)控T細胞免疫狀態(tài)的機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　缺血性心臟病嚴重威脅人類生命健康，心肌梗死發(fā)作時有十億級的心肌細胞發(fā)生死亡，之后死亡的心肌組織被疤痕所代替，缺乏正常的心肌收縮舒張功能，嚴重影響患者生活質(zhì)量。近年來，干細胞移植成為新方法之一，其中間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有分化成心肌細胞的能力，可以替代缺血壞死的心肌細胞。盡管移植的MSC對心肌有保護作用，但研究發(fā)現(xiàn)移植的MSC難以存活，且極為少數(shù)的MSC會向心肌

2、細胞分化，因此MSC對心肌的保護是間接的。
　　MSC表面表達CD73，CD90和CD105。其中CD73又稱之為外膜5-核苷酸酶(ecto-5-nucleoditase，NT5E)，其功能是細胞外催化一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate，AMP)生成腺苷，而腺苷可以作用于細胞上的腺苷受體(adosinereceptors，ARs)，分為A1，A2A，A2B和A3型腺苷受體四種(A1R，A2AR，A2BR和A3

3、R)。MSC可以通過免疫調(diào)控，作用于免疫細胞以達到對心肌的保護。其中激活的T細胞高表達A2AR和A2BR，而已經(jīng)有研究證實激活CD4+T細胞上的A2AR可以誘導(dǎo)其向T調(diào)節(jié)細胞(T regulatory cells，Tregs)分化，Tregs具有免疫抑制和組織保護的作用。然而T細胞上A2BR的激活是否能夠誘導(dǎo)Tregs，以及T細胞上A2BR在干細胞治療中的作用還有待闡明。
　　本課題通過假設(shè)“干細胞CD73→腺苷→T細胞上A2BR

4、s→免疫抑制→心肌保護”以驗證干細胞所產(chǎn)生的腺苷是否通過調(diào)控T細胞表面A2BRs，產(chǎn)生抗炎效應(yīng)，從而為心肌再生提供有利條件。通過進一步研究MSC對T細胞的作用，從而闡明MSC在心肌缺血中的免疫調(diào)控機制，為指導(dǎo)治療提供更多新的理論證據(jù)。
　　實驗對象及方法:
　　一、探索MSC表面CD73的功能
　　1.將大鼠分為假手術(shù)組、心梗組和心梗+干細胞移植組，5天后取出心臟將其懸掛在藍格多夫(Langendorff)裝置上，使用

5、Krebs緩沖液進行灌注使心臟跳動，采用“倒掛心臟法”收集心臟滲出液，通過高壓液相層析（highpressure/performance liquid chromatography，HPLC）檢測其腺苷濃度。
　　2.選野生型C57BL/6小鼠（下同，轉(zhuǎn)基因小鼠會特別說明）和CD73-/-小鼠兩組，提取其脂肪源性間充質(zhì)干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)。體外培養(yǎng)并擴

6、增后，第一部分細胞行流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測CD73的表達;第二部分細胞行實時熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)檢測腺苷生成分子CD39和CD73，以及其他細胞因子的表達;第三部分繼續(xù)培養(yǎng)為后續(xù)共培養(yǎng)實驗做準備。
　　二、探索CD73+MSC對T細胞的調(diào)控作用
　　1.選野生型小鼠，分離其淋巴細胞，并用抗CD3和CD28抗體共同刺激3天，再行CD4+T細胞的磁珠分選。分選

7、后的CD4+T細胞與ADMSC（野生型和CD73-/-小鼠）共培養(yǎng)24小時，之后使用qPCR檢測T細胞相關(guān)分子。
　　2.由于FCM發(fā)現(xiàn)小鼠ADMSC所表達的CD73不如人臍帶血間充質(zhì)干細胞（human umbilical vein mesenchymal stem cells，hUVMSC，之后簡稱MSC），故之后的實驗使用該細胞進行實驗。按照上述方法分選后CD4+T細胞后與MSC共培養(yǎng)24小時，分選后先行CFSE染色（增殖指標

8、），之后用qPCR測T細胞相關(guān)分子，bioplex檢測上清干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ），F(xiàn)CM測抗炎分子CD39和CD73，并檢測增殖狀態(tài)。
　　3.根據(jù)上述實驗發(fā)現(xiàn)了MSC可以促進T細胞向Tregs分化，故將na(i)ve CD4+T細胞激活后，馬上與MSC共培養(yǎng)72小時，之后用FCM測轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的水平。
　　三、探索凋亡CD73+MSC對T細胞的調(diào)控作用
　　1.干細胞移植入梗死

9、心肌后會逐漸凋亡，為了盡可能模擬干細胞在體內(nèi)的真實狀態(tài)，使用星形孢菌素誘導(dǎo)MSC凋亡，并行凋亡染色。之后對正常/凋亡的干細胞行CD73的流式檢測，以證實凋亡干細胞是否可能生成更多腺苷。
　　2.按照上述方法行CD4+T細胞分選，分選后先行CFSE染色，再與凋亡的MSC共培養(yǎng)24小時，之后用qPCR測T細胞相關(guān)分子，F(xiàn)CM測抗炎分子CD39和CD73，并檢測其增殖狀態(tài)。
　　3.同第二部分，將na(i)ve CD4+T細胞激活

10、后，馬上與凋亡的MSC共培養(yǎng)72小時，之后用FCM測轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的水平。
　　四、探索CD73下游A2B腺苷受體在調(diào)控T細胞過程中的作用
　　1.選野生型小鼠和A2BR-/-小鼠兩組，行CD4+T細胞分選，分選后與正常和凋亡MSC共培養(yǎng)24小時，之后行qPCR檢測T細胞相關(guān)分子，F(xiàn)CM檢測T細胞抗炎分子CD39。為了更一步證實A2BR的作用，部分實驗在培養(yǎng)T細胞前對其使用A2BR拮抗劑。
　　2.類似，將na(i

11、)ve CD4+T細胞激活后，首先使用A2BR拮抗劑，再馬上與正常和凋亡的MSC共培養(yǎng)72小時，之后用FCM測轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的水平。
　　結(jié)果:
　　一、MSC表面CD73的功能分析
　　在心肌灌注中，CD73+MSC處理過的心臟滲出液中含有更多的腺苷。體外培養(yǎng)中，CD73-/-MSC表達更低水平的腺苷生成酶（CD39和CD73）。
　　二、CD73+MSC對T細胞調(diào)控的分析
　　CD73+MSC對T細

12、胞有免疫抑制作用，CD73缺失后該作用也會消失。MSC與T細胞在長時間的共培養(yǎng)后，MSC可以誘導(dǎo)T細胞向Tregs分化。
　　三、凋亡CD73+MSC對T細胞調(diào)控的分析
　　凋亡的MSC其表面表達更多CD73，可能生成更多細胞外腺苷，對T細胞的免疫抑制更強。但凋亡MSC與T細胞在長時間的共培養(yǎng)后，凋亡MSC不能誘導(dǎo)T細胞向Tregs分化，所產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)主要是由于凋亡的MSC總體抑制了T細胞增殖水平。
　　四、CD

13、73下游A2B腺苷受體在調(diào)控T細胞過程中的作用
　　CD4+T細胞上的A2BR參與了正?；虻蛲鯩SC對T細胞的免疫抑制，也參與了T細胞向Tregs的分化過程。
　　結(jié)論:
　　CD73+MSC移植于梗死心肌后，灌注的心臟能滲出更多腺苷;MSC上的CD73能維持穩(wěn)定的抗炎環(huán)境，為心肌修復(fù)提供有利條件。CD73+MSC所產(chǎn)生的細胞外腺苷能抑制T細胞的免疫狀態(tài)，長時間的腺苷刺激可以T細胞向Tregs分化。凋亡的CD73+MS