哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)促進腎臟衰老的機制研究.pdf

1、腎臟功能隨著年齡增長逐漸下降，老年人慢性腎臟疾病的發(fā)生率高，且治療有效率低，死亡率高，所以研究腎臟衰老的機制和尋找延緩腎臟衰老的策略對老年腎臟損害的防治有重要意義。腎臟衰老的特征是隨年齡增長出現(xiàn)腎小球肥大、系膜增生、腎小球硬化和腎小管-間質纖維化等病理變化。但出現(xiàn)這一現(xiàn)象的分子機制并不完全清楚。近年來有學者發(fā)現(xiàn)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特異性的抑制劑雷帕霉素可抑制腎小

2、球肥大及腎小管-間質的炎癥和纖維化。另外，越來越的證據(jù)表明mTOR與細胞及機體衰老有著千絲萬縷的聯(lián)系，因此我們推斷，mTOR參與了腎臟病變發(fā)生發(fā)展的過程，其表達異常可能在腎臟衰老過程中發(fā)揮著某種作用。為此本研究首先觀察mTOR在不同月齡大鼠腎臟組織的表達情況；并培養(yǎng)不同月齡的原代大鼠系膜細胞及WI-38細胞，觀察mTOR在細胞中隨齡表達變化；再以細胞周期為切入點，進一步研究mTOR在細胞衰老進程中的作用機制。 目的：研究mTOR

3、在大鼠系膜細胞/腎組織中隨增齡的表達變化及在細胞衰老過程中的作用機制。 方法：取3月齡、12月齡和24月齡大鼠的腎臟組織，用RT-PCR及Western blot的方法，觀測mTOR mRNA和蛋白質的表達變化；用免疫組化法觀察mTOR在腎組織中的定位和表達。并分離培養(yǎng)各時間點大鼠腎臟系膜細胞及WI38細胞，觀測mTOR mRNA和蛋白質及其他衰老相關指標在細胞隨齡的變化情況，用免疫熒光法檢測mTOR的定位和表達變化。應用mTO

4、R的激動劑和抑制劑分別干預WI38細胞，檢測衰老的相關指標，包括用β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色方法檢測了衰老相關SA-β-gal染色陽性率，用流式細胞儀檢測了細胞周期的變化及細胞大小，并計數(shù)了細胞分裂的代數(shù)等。并利用激光共聚焦技術觀察mTOR與細胞周期負向調控蛋白p21WAF1/CIP1/SDI1之間的關系，從而進一步明確mTOR在細胞衰老過程中的作用機制。 結果：①、mTOR在腎小球系膜基質及腎小管-間質表達，其

5、mRNA和蛋白表達水平及磷酸化的活性蛋白隨增齡逐漸上升，且其與增齡引起的腎臟病變有顯著相關性。②、mTOR在細胞胞漿及胞核皆有表達，在不同細胞（大鼠原代系膜細胞及人胚肺二倍體成纖維細胞）衰老過程中，其表達隨月齡/代齡的增加而逐漸增強。③、mTOR的激動劑能上調P21WAF1/CIP1/SDI1及Cyclin D1基因及蛋白質的表達，引起細胞周期阻滯，促進細胞肥大，縮短細胞的傳代次數(shù)；mTOR的抑制劑能下調P21WAF1/CIP1/SDI