丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5A對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的調(diào)節(jié)及其功能研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起急、慢性肝炎的重要肝嗜性病毒之一。然而,目前對HCV感染慢性化和免疫逃逸的致病機理仍然缺乏全面深入的理解。要建立持續(xù)性感染,病毒必須調(diào)控參與細胞存活、生長、生物大分子合成和代謝的關(guān)鍵信號通路。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路即為這樣的信號通路。已發(fā)現(xiàn)多種DNA病毒調(diào)控mTOR通路以促進持續(xù)性感染和致病。同

2、時,凋亡作為維持細胞穩(wěn)定性的重要生理機制,其功能失調(diào)常常見于持續(xù)性病毒感染。我們前期發(fā)表的結(jié)果表明HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5A(nonstructural protein5A,NS5A)結(jié)合細胞蛋白FKBP38從而抑制細胞凋亡,但其機理不詳。近期發(fā)現(xiàn)FKBP38為mTOR通路新成員,在營養(yǎng)或生長因子控制下,FKBP38結(jié)合并抑制mTOR激酶活性。為了進一步理解NS5A的生物學活性以及HCV持續(xù)性感染的致病機理,本實驗研究了HCV NS5A對mT

3、OR信號通路的調(diào)節(jié)及其對細胞存活的影響。
　　在人肝癌細胞系Huh7中過表達HCV NS5A的結(jié)果表明,血清饑餓條件下NS5A以時間和劑量依賴方式增加mTOR下游靶點S6K1和4EBP1磷酸化水平。而在10％血清存在條件下,NS5A不能提高S6K1和4EBP1磷酸化水平。同樣,在血清饑餓條件下,NS5A穩(wěn)定表達的Huh7細胞(NS5A-Huh7)和HCV亞基因組復制子細胞中,S6K1和4EBP1磷酸化水平明顯高于對照細胞(neo-

4、Huh7)。mTOR特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin)或NS5A特異性的siRNA(siNS5A)可阻斷。NS5A對S6K1和4EBP1的磷酸化作用,提示NS5A特異性的活化mTOR信號通路。但是,在NS5A-Huh7細胞中,P13K特異性抑制劑LY294002不能阻斷NS5A對S6K1和4EBP1的磷酸化作用,表明NS5A活化mTOR通路不依賴于其上游組分P13K。進一步運用NS5A突變體(NS5A-△I,不與FKBP38結(jié)合

5、)、FKBP38突變體(FKBP38-△3×TPR,不與NS5A結(jié)合)以及FKBP38特異性siRNA(siFKBP38)研究發(fā)現(xiàn),NS5A對mTOR通路的活化作用依賴于NS5A與FKBP38的結(jié)合。
　　為了探索NS5A活化mTOR信號通路的機制,我們考察了NS5A、FKBP38、mTOR三者的結(jié)合情況。在過表達NS5A的Hela和Huh7細胞中,運用GST-pull down方法證明,在血清饑餓條件下,GST-FKBP38與r

6、oTOR的結(jié)合消失,而GST-FKBP38仍與NS5A結(jié)合。這些結(jié)果在NS5A-Huh7和HCV亞基因組復制子細胞中得到了一致的驗證。更重要的是,在NS5A-Huh7和HCV亞基因組復制子細胞中,GST-FKBP38-△3×TPR可回復性結(jié)合mTOR。這些結(jié)果提示NS5A可破壞FKBP38與mTOR的結(jié)合。與GST-pulldown結(jié)果相同,在同時過表達FKBP38與NS5A的Huh7細胞中,免疫共沉淀實驗表明,血清饑餓條件下FKBP3

7、8與mTOR的結(jié)合消失,FKBP38仍與NS5A結(jié)合。同時,有無血清并不影響NS5A-FKBP38的結(jié)合。單獨過表達FKBP38且無血清存在時,FKBP38與mTOR結(jié)合,而有血清存在時兩者結(jié)合消失。NS5A與mTOR之間不存在直接或間接結(jié)合。這些結(jié)果在neo-Huh7、NS5A-Huh7及HCV亞基因組復制子細胞中得到了進一步驗證。另外,同時過表達NS5A-△I和FKBP38、或NS5A和FKBP38-△3×TPR時,可恢復mTOR與

8、FKBP38的結(jié)合。共定位分析發(fā)現(xiàn),血清饑餓條件下,NS5A-Huh7、HCV Replicon細胞中FKBP38與mTOR的共定位消失。這些結(jié)果提示NS5A是通過與mTOR競爭結(jié)合后者內(nèi)源性抑制劑FKBP38,從而活化mTOR信號通路。
　　以往研究表明mTOR信號通路活化可促進細胞存活。因此,我們進一步在無血清存在條件下利用凋亡誘導劑星孢菌素(stauroporine)考察了NS5A活化mTOR信號通路對細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)

9、現(xiàn),無rapamycin預處理的NS5A-Huh7中,caspase3和PARP活化水平明顯低于rapamycin預處理的NS5A.Huh7細胞、rapamycin處理或不處理的對照neo-Huh7細胞。Hoechst33342染色結(jié)果也表明,rapamycin未處理的NS5A-Huh7凋亡數(shù)量明顯低于rapamycin處理的NS5A.Huh7細胞、以及raparnycin處理或不處理的對照neo-Huh7細胞。而且,NS5A特異性si

10、RNA可明顯恢復NS5A-Huh7細胞對staurosporine誘導凋亡的敏感性,表現(xiàn)為caspase3和PARP活化水平明顯升高。這些結(jié)果提示NS5A通過mTOR信號通路特異性抑制細胞凋亡。進一步實驗表明,同時過表達NS5A和FKBP38且無rapamycin預處理的Huh7細胞中,caspase3、PARP活化水平低于同時過表達NS5A和FKBP38-△3×TPR、或NS5A-△I和FKBP38且rapamycin預處理或不預處理

11、的Huh7細胞。與此一致,用FKBP38特異性siRNA(siFKBP38)單獨處理NS5A-Huh7、HCV亞基因組復制子細胞發(fā)現(xiàn),其caspase3、PARP活化水平明顯低于rapamycin聯(lián)合siFKBP38處理或rapamycin單獨處理的細胞。Hoechst33342染色也得到一致的結(jié)果。這些結(jié)果提示,NS5A通過mTOR信號通路抑制細胞凋亡依賴于NS5A-FKBP38結(jié)合。
　　上述結(jié)果表明,HCV NS5A通過與m