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文檔簡介
1、 目的：進(jìn)行丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建,并分析鑒定其在體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞QSG7701中的表達(dá)。
方法：用PCR方法從含有丙肝病毒全長基因的重組質(zhì)粒pBRTM/HCV1-3011表達(dá)載體中擴(kuò)增出HCV NS3基因片段,將其與表達(dá)載體pcDNA3.1(-)重組,得到重組的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/NS3。然后采用陽離子多聚體介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞QSG7701,以免疫組織化學(xué)SP法檢測到細(xì)胞中NS
2、3蛋白表達(dá)陽性后,即用G418篩選出可穩(wěn)定表達(dá)HCV NS3蛋白的系統(tǒng)。對穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞提取其細(xì)胞質(zhì)蛋白,用SDS-PAGE電泳及Western Blotting印跡法檢測細(xì)胞表達(dá)的HCV NS3蛋白。
結(jié)果：所得到的NS3片段大小正確,序列正確,并在兩端成功插入起始、終止密碼子和EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn)。所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞并可穩(wěn)定表達(dá)HCV NS3蛋白,表達(dá)的特異性NS3蛋白分子量為預(yù)期的7
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