丙型肝炎病毒基因組3′非編碼區(qū)與細胞蛋白U2B作用的研究.pdf

1、本研究首先應用T7噬菌體展示庫技術，以HCV3'NCR為誘餌篩檢T7噬菌體人肝細胞文庫，尋找與HCV3NCR相互作用并參與HCV基因復制的細胞蛋白。首先體外轉錄了來自HCV基因組全長的3'NCR，使之與生物素標記的寡聚DNA退火結合，經過三輪的重復篩選，最終獲得5個細胞蛋白，分別為剪接因子U2B、線粒體上的NADH脫氫酶亞單位3、細胞色素c氧化酶亞基Ⅱ、細胞色素P450超家族成員及一種功能未知的蛋白?！　』赗NA剪接因子可能與HCV

2、3'NCR相互作用、調節(jié)HCV復制的推測，本研究進一步探討了剪接因子U2B蛋白在HCV基因復制中的作用。通過構建了針對U2B蛋白的RNA干擾重組質粒，發(fā)現可特異、有效地抑制HCV亞基因組復制子細胞中內源性U2B蛋白的表達。進一步通過定量RT-PCR和WesternBlot分別檢測U2B表達抑制后復制子細胞中HCV復制、翻譯的改變，發(fā)現HCV亞基因組復制子細胞中內源性U2B蛋白的表達被抑制后，該細胞中HCV亞基因組的病毒RNA和蛋白質水平

3、反而比對照組有顯著增加，提示U2B參與調節(jié)HCV的復制且對HCV的復制、翻譯有負調控作用?！　榱蓑炞C核蛋白U2B在HCV復制子細胞中能定位于HCV復制發(fā)生的胞漿，進一步分離了復制子細胞的各亞細胞組分(包括HCV復制復合體所在的脂筏結構)，通過WesternBlot發(fā)現在HCV復制子細胞的胞漿及脂筏結構中均有U2B的分布，說明U2B蛋白可以參與到HCV的復制過程，推測其可能是HCV復制復合體的組分之一?！　【C上所述，本研究應用T7噬