冷休克蛋白參與神經(jīng)保護(hù)作用的分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：
　　背景：亞低溫技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及臟器移植手術(shù)中,降低溫度可以使組織器官的代謝率下降,對(duì)心、腦、肝臟等主要臟器功能有明顯的保護(hù)作用。低溫通過怎樣的途徑對(duì)臟器產(chǎn)生保護(hù)作用,其相關(guān)作用的途徑是本研究關(guān)心的重點(diǎn)。近些年研究發(fā)現(xiàn)有一類分子,如CIRP(cold inducible RNA-binding protein,冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白)在多種生物表現(xiàn)出經(jīng)亞低溫處理后可被大量誘導(dǎo)的特性。我們前期的研究還

2、證實(shí)CIRP表達(dá)增加能夠顯著減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,因此本次研究利用分子克隆及體外培養(yǎng)技術(shù),先后對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行亞低溫、CIRP過表達(dá)及針對(duì)CIRP進(jìn)行RNA干擾處理,深入探索上述各實(shí)驗(yàn)組中,CIRP參與抗神經(jīng)元凋亡過程中的相關(guān)分子及可能的抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　目的：通過檢測亞低溫或過表達(dá)CIRP條件下參與抑制神經(jīng)元凋亡的相關(guān)因子,進(jìn)一步闡明亞低溫下冷休克蛋白參與神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制及亞低溫治療腦損傷的作用機(jī)理,為開

3、發(fā)腦或其它臟器功能保護(hù)的新方法提供理論依據(jù)。
　　方法：采取體外分離并接種培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元的方式,應(yīng)用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記法對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行流式凋亡檢測、透射電鏡掃描觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)、慢病毒包裝CIRP過表達(dá)和shRNA干擾載體并侵染神經(jīng)元、實(shí)時(shí)定量PCR檢測信號(hào)傳導(dǎo)通路的基因表達(dá)分布(RT2 Profiler PCR Arrays Pathway Analysis)及Western blotting等方法分別從

4、細(xì)胞、基因和蛋白水平上研究亞低溫下CIRP介導(dǎo)抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上相關(guān)因子的變化情況。
　　結(jié)果：通過流式凋亡檢測和透射電鏡掃描后觀察到亞低溫處理后神經(jīng)元凋亡的數(shù)量明顯下降,神經(jīng)元胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)相對(duì)保持完整。實(shí)時(shí)定量PCR檢測信號(hào)傳導(dǎo)通路的基因表達(dá)分布結(jié)果顯示:亞低溫32℃12h處理組與37℃對(duì)照組比較分析結(jié)果為,84條凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子中有12條基因表達(dá)上調(diào),38條基因表達(dá)下調(diào),其余34條基因無明顯變化;過表達(dá)CIRP組與3

5、7℃對(duì)照組比較分析結(jié)果為,15條基因表達(dá)上調(diào),46條基因表達(dá)下調(diào),其余23條基因無明顯變化;CIRP表達(dá)沉默后進(jìn)行32℃12h處理組與37℃對(duì)照組比較分析結(jié)果為,9條基因表達(dá)上調(diào),40條基因表達(dá)下調(diào),其余35條基因無明顯變化。整合處理數(shù)據(jù)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CIRP與亞低溫32℃12h處理后存在著一些共同變化的因子,并且其中部分因子在進(jìn)行RNA干擾CIRP表達(dá)并32℃12h處理之后未發(fā)生相應(yīng)變化。對(duì)這部分因子仔細(xì)分析后,發(fā)現(xiàn)它們的分布和變

6、化情況基本符合線粒體凋亡途徑,相關(guān)因子包括Bcl-2、Bax、Bad、Bak,Cycs、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3等。Western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)各因子蛋白水平的變化情況與基因水平變化基本一致:對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行亞低溫32℃12h處理后目的蛋白CIRP和RBM3表達(dá)均顯著升高,Bcl-2、Akt、p-ERK1/2表達(dá)水平也隨之升高,而Bax、Bad、Bak,Cycs、Apaf-1、Caspase-9、

7、Caspase-3等表達(dá)均有不同程度的降低;過表達(dá)CIRP處理后各因子的變化趨勢與亞低溫32℃12h處理后基本一致;RNA干擾CIRP表達(dá)并32℃12h處理后各因子均未見明顯變化。
　　結(jié)論：亞低溫下冷休克蛋白表達(dá)增高,之后激活并啟動(dòng)CIRP介導(dǎo)的抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,主要通過阻斷線粒體凋亡途徑,抑制神經(jīng)元凋亡,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。由此認(rèn)為冷休克蛋白可能參與亞低溫的神經(jīng)保護(hù)功能,并在其分子調(diào)控方面起著重要的作用,同時(shí)為亞低溫治療腦

8、損傷的作用機(jī)理提供了一定依據(jù)。
　　第二部分：
　　背景：近幾年國外也有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn),此類蛋白在許多系統(tǒng)的腫瘤中均表達(dá)偏高,認(rèn)為其可能參與腫瘤的發(fā)生、增殖及惡化等諸多環(huán)節(jié)。由于目前在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中未見相關(guān)明確報(bào)道,因此,本階段首先立足于神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,即星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤,分別在低級(jí)別(WHOI-II級(jí))、高級(jí)別星形細(xì)胞瘤(WHOIII-IV級(jí))和正常腦組織中進(jìn)行冷休克蛋白的差異表達(dá)研究,并且同時(shí)從mRNA和蛋白水平進(jìn)

9、行檢測,研究目的主要是從另外一個(gè)角度出發(fā),通過觀察其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的影響情況,從而探索其參與神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的其它可能方式。
　　目的：探討冷休克蛋白CIRP和RBM3在人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)含量及其與腫瘤惡性程度的相互關(guān)系。
　　方法：采用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)、EnVision免疫組化染色及Western blotting等方法分別從mRNA和蛋白水平上檢測正常腦組織與不同級(jí)別星形細(xì)胞瘤中冷休克蛋白的表達(dá)情

10、況。
　　結(jié)果：通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測,結(jié)果提示基因CIRPmRNA在各級(jí)別星形細(xì)胞瘤與正常腦組織中的表達(dá)未見明顯差異;而同家族的另一個(gè)基因RBM3 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常腦組織,并且高級(jí)別與低級(jí)別星形細(xì)胞瘤之間存在顯著差異,尤其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251和U87中表達(dá)水平更為突出。先后通過免疫組織化學(xué)和Western blotting方法,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白CIRP和RBM3在正常腦組織與各級(jí)別星形細(xì)胞瘤中均有不同程度表達(dá),且定

11、位于細(xì)胞核中,其中CIRP在星形細(xì)胞瘤與正常腦組織中的表達(dá)未見明顯差異,而RBM3在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于正常腦組織,并且其表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的升高而逐漸升高。
　　結(jié)論：冷休克蛋白中CIRP基因在人腦星形細(xì)胞瘤和正常腦組織中未見明顯差異表達(dá),而同家族的另一個(gè)基因RBM3無論在mRNA還是蛋白水平上表達(dá)均明顯高于正常腦組織,并且高級(jí)別與低級(jí)別星形細(xì)胞瘤之間存在顯著差異,由此推論RBM3的過度表達(dá)可能與星形細(xì)胞瘤的惡性程度密切相關(guān)