當歸多糖調控造血干細胞衰老的機制研究.pdf

1、目的：
　　 成體干細胞是維持組織穩(wěn)態(tài)的重要因素，并在機體衰老進程中起關鍵作用。造血干細胞(hematopoietic Stem cells，HSCs)是干細胞研究領域中開展最早、技術最成熟、認識最深入并且廣泛應用于臨床的一種成體干細胞。衰老機體中造血系統(tǒng)基本成分雖然得以維持，但HSCs的功能和數量卻逐漸降低，將導致免疫功能衰退和多種老年性疾病的發(fā)生。
　　 當歸多糖（angelica sinensis polysacc

2、haride，ASP）是從當歸中分離、提取的藥用有效成分，具有促進造血、抗輻射損傷、抗腫瘤和免疫調節(jié)等作用。目前，有關ASP能否延緩HSCs衰老及其作用機制尚不清楚。本研究將干細胞研究技術和祖國傳統(tǒng)的抗衰老醫(yī)學理論相結合，采用HSCs體外衰老模型的復制和X線照射致小鼠HSCs衰老等現代生物學的研究手段，分別從體外與體內兩條途徑系統(tǒng)地探討ASP調控HSCs衰老的作用及其可能的生物學機制，旨為重新激活衰老HSCs及調控其靶向分化提供實驗依據

3、和理論基礎。
　　 方法：
　　 1.免疫磁珠分選技術（magnetic-activated cell sorting，MACS）分離、純化干細胞抗原-1(Sca-1+) HSCs，流式細胞術測定細胞分選純度，臺酚藍染色檢測細胞活性。
　　 2.采用衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、細胞周期分析、甲基纖維素半固

4、體培養(yǎng)等方法，觀察氧化低密度脂蛋白(oxidation lowdensity lipoprotein，ox-LDL)對Sca-1+HSCs衰老生物學特性的影響，以建立ox-LDL體外誘導Sca-1+HSCs衰老模型。
　　 3.ASP與ox-LDL共培養(yǎng)Sca-1+HSCs，采用SA-β-Gal染色、細胞周期分析及甲基纖維素半固體培養(yǎng)觀察衰老生物學指標的變化;酶學比色法測定細胞培養(yǎng)上清液超氧化物歧化酶(superoxide di

5、smutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;免疫熒光檢測Sca-1+HSCs內活性氧(reactive oxygen specie，ROS)水平;熒光定量PCR及Western blot檢測Sca-1+HSCs衰老相關基因p16、p21mRNA及細胞周期調控蛋白P16、P21、CDK2、CDK4、cyclinD及cycl

6、inE表達的變化;Southern blot和TRAP-PCR檢測Sca-1+HSCs端粒長度與端粒酶活性，以闡明ox-LDL體外誘導Sca-1+HSCs衰老及ASP體外調控Sca-1+HSCs衰老的生物學機制。
　　 4.X線3.0Gy/8F全身均勻照射(total body irradiation，TBI)小鼠，采用SA-β-Gal染色、細胞周期分析、甲基纖維素半固體培養(yǎng)等方法，觀察X線TBI對小鼠對Sca-1+HSCs衰老

7、生物學特性的影響，以建立小鼠Sca-1+HSCs體內衰老模型。
　　 5.小鼠X線3.0Gy/8F全身均勻照射期間給予ASP灌胃，采用SA-β-Gal染色、細胞周期分析及甲基纖維素半固體培養(yǎng)觀察衰老生物學指標的變化;酶學比色法測定Sca-1+HSCs總抗氧化能力(totalanti-oxidant，T-AOC);免疫熒光檢測Sca-1+HSCs內ROS水平;熒光定量PCR及Western blot檢測HSCs衰老相關基因p16、

8、p21mRNA及細胞周期調控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、cyclinD及cyclin E表達的變化;Southern blot和TRAP-PCR測定Sca-1+HSCs端粒長度與端粒酶活性，以闡明3.0Gy/8F的X線TBI體內誘導Sca-1+HSCs衰老及ASP體內調控Sca-1+HSCs衰老的生物學機制。
　　 結果：
　　 1.MACS分離純化后Sca-1+細胞純度為(86.21±6.17)％，顯著高于

9、分離純化前Sca-1+細胞百分比為(11.45±1.87)％;臺盼藍染色法測定分選的Sca-1+HSCs活性為（93.65±4.54）％。表明分選的Sca-1+HSCs細胞有較高的純度和良好的活性。
　　 2.ox-LDL體外誘導Sca-1+HSCs呈現典型的衰老生物學表現:SA-β-Gal染色陽性細胞率明顯增加;增殖能力明顯減弱;G1期細胞比例顯著升高、S期細胞比例顯著減少;混合集落形成單位(colonyforming uni

10、t-mixture，CFU-Mix)數量顯著減少。ox-LDL可誘導衰老Sca-1+HSCs培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px活性下降及MDA含量升高;細胞內ROS水平增加;端粒長度縮短，端粒酶活性降低;p16、p21mRNA及蛋白表達增強，CDK4、cyclinD及cyclinE蛋白表達降低，而對CDK2蛋白表達無影響。
　　 3.ASP體外作用于衰老Sca-1+HSCs可降低其SA-β-gal染色陽性細胞率、G1期細胞比例及P1

11、6表達;增加S期細胞比例及CDK4、cyclinD蛋白表達;抑制端粒DNA損傷;而對CFU-Mix數量、ROS水平、細胞培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px活性與MDA含量、P21、CDK2、cyclinE蛋白表達及端粒酶活性均無明顯影響。
　　 4.X線3.0Gy/8F全身均勻照射誘導小鼠Sca-1+HSCs呈現典型的衰老生物學表現:SA-β-Gal染色陽性細胞率明顯增加;G1期細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著減少;CFU-Mix

12、數量顯著減少。3.0Gy/8F的X線可誘導衰老Sca-1+HSCs T-AOC下降，ROS水平增加;端粒長度縮短、端粒酶活性降低;p16、p21 mRNA及蛋白表達增強，CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表達降低，而對CDK2蛋白表達無影響。
　　 5.ASP體內作用于衰老Sca-1+HSCs后可降低其SA-β-gal染色陽性細胞率下降及G1期細胞比例、增加S期細胞比例及CFU-Mix數量;增加細胞T-AOC、降低RO

13、S水平;抑制端粒DNA損傷，增強端粒酶活性;下調p16、p21mRNA及蛋白表達，上調CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表達，CDK2蛋白表達無顯著性變化。
　　 結論：
　　 1.MACS可有效分選小鼠Sca-1+HSCs，分離純化的Sca-1+HSCs純度較高，活性良好。
　　 2.ox-LDL可作為一種體外復制Sca-1+HSCs衰老模型的有效致衰劑。
　　 3.ASP體外作用可通過調節(jié)部