ILK與腦膠質(zhì)瘤對TMZ耐藥性和EMT的關系及機制的研究.pdf

1、前言
　　腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的起源于神經(jīng)上皮組織的原發(fā)惡性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46％。統(tǒng)計資料表明腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3～10/10萬，占全身惡性腫瘤的1％～3％，手術加放化療的平均生存期僅為8～11個月。膠質(zhì)瘤對化療藥物耐藥導致了化療對膠質(zhì)瘤治療效果不理想，是膠質(zhì)瘤術后平均生存期較低的主要原因之一。因此，研究膠質(zhì)瘤對化療藥物的耐藥機制，對于開發(fā)新的化療藥物，尋找膠質(zhì)瘤新的治療靶點都具有十分重要的意義。
　　整合素連

2、接激酶(integrinlinkedkinase，ILK)是Hannigan等人在1996年人類cDNA文庫雙酵母雜交篩選實驗中，應用β1整合素胞漿結構域發(fā)現(xiàn)的，它是一種含有3個結構域的Ser/Thr蛋白激酶，ILK的cDNA全長為1.8kb，由452個氨基酸殘基組成。編碼人類ILK的基因定位于人染色體11p15.5-p15.4，基因全長為8.8kb，包括13個外顯子和12個內(nèi)含子。ILK活性較低，在細胞與ECM粘附時或生長因子作用下，

3、通過PI3K依賴激活機制被激活，可能的調(diào)控機制為PI3K的產(chǎn)物3，4，5-三磷酸肌醇PIP3通過磷酸肌醇結合序列和ILK的PH序列直接結合而發(fā)揮作用。ILK可以被PTEN和ILKAP兩個磷酸酶負性調(diào)控。在ILK過表達的細胞中分析ILK活性，發(fā)現(xiàn)它能激活多種信號傳導途徑。上皮細胞ILK過表達可導致PKB/Akt和GSK-3磷酸化表達增加。近年來幼大量的研究表明ILK可通過誘導上皮間質(zhì)轉化(EMT)而促進腫瘤細胞惡性表型出現(xiàn)，多種類型腫瘤E

4、MT中通過NF-κB通路起著重要的調(diào)控作用。Duxbury等人的研究還表明通過RNAi抑制ILK的表達可降低胰腺癌細胞對吉西他濱的化療耐藥性，提示ILK可能與腫瘤的多藥耐藥有關。然而，ILK是否也與腦膠質(zhì)瘤的耐藥有關仍然不清楚。本實驗通過過表達ILK研究其對膠質(zhì)瘤耐藥性的影響;通過轉染ILK基因觀察其是否可以引起重組轉染組腫瘤細胞的侵襲及轉移能力增加及其機制;應用NF-κB阻斷劑阻斷該通路，探討ILK是否通過NF-κB通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞

5、的EMT。
　　材料和方法
　　一、過表達ILK促進腦膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺耐藥
　　擴增人ILK全長編碼序列，將目的基因和真核表達載體pEWP-C1質(zhì)粒（含Neo抗性基因）行定向連接，將其產(chǎn)物轉化細菌感受態(tài)細胞，應用PCR方法鑒定陽性克隆，并行測序和分析對比，可獲得融合蛋白表達質(zhì)粒載體pEGFP-C1-ILK。然后通過陽離子脂質(zhì)體介導將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ILK轉染到體外培養(yǎng)的SHG-44細胞，經(jīng)G418篩選，建

6、立穩(wěn)定表達ILK的膠質(zhì)瘤細胞系。
　　實驗細胞分三組:對照組、空載組及穩(wěn)定轉染組。
　　應用Westernblot和RTPCR法進行轉染鑒定。應用MTT法檢測各組細胞的增殖，應用Hoechst法及流式細胞術檢測各組細胞的凋亡，并檢測抗凋亡蛋白、凋亡蛋白的表達情況及Caspase的活性。
　　二、過表達ILK促進腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉移
　　實驗細胞分三組:對照組、空載組及穩(wěn)定轉染組
　　分別應用Elisa法及

7、Westernblot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、2的表達
　　應用細胞劃痕實驗測定細胞遷移率，應用Transwell實驗檢測細胞侵襲的程度。利用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　三、過表達ILK通過NF-κB信號通路促進腦膠質(zhì)瘤細胞的上皮間質(zhì)轉化
　　分別應用NF-κB特異性阻斷劑BAY11-7028及siRNA方法阻斷NF-κB信號傳導通路
　　實驗分七組:對照組、空載組、穩(wěn)定轉染組、空載+BAY11-70

8、28組、穩(wěn)定轉染+BAY11-7028組、空載+p65siRNA組、穩(wěn)定轉染+p65siRNA組
　　首先應用Westernblot方法檢測對照組、空載組及穩(wěn)定轉染組的EMT標記物snail、slug、twist、vimentin、E-cadherin蛋白表達的檢測，然后阻斷NF-κB信號通路后，再次檢測上皮標記物E-cadherin蛋白表達。
　　結果
　　一、過表達ILK促進腦膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺耐藥
　　重

9、組質(zhì)粒pEGFP-C1-ILK鑒定:所得的PCR片段和預期大小1.8kbp相一致。將陽性克隆測序，測序結果應用cnkiblast分析，證實插入的目的片段與基因庫檢索的人ILK的cDNA序列100％匹配，證明PCR過程中無突變發(fā)生。以上結果證實重組質(zhì)粒pEGFP-C1-ILK構建成功。然后應用G418篩選出穩(wěn)定轉染ILK的SHG-44膠質(zhì)瘤細胞系。
　　轉染鑒定:Westernblot的結果顯示:轉染組的ILK蛋白表達明顯高于空載組

10、及對照組(P＜0.01)，RT-PCR顯示:穩(wěn)定轉染組ILK明顯高于對照組的表達(P＜0.01)，以上的結果證實ILK轉染成功。
　　Westernblot法檢測各組細胞中多藥耐藥基因MDR、MRP蛋白質(zhì)的表達結果顯示:穩(wěn)定轉染組細胞的MDR、MRP蛋白質(zhì)表達均明顯增高，說明穩(wěn)定轉染ILK的膠質(zhì)瘤細胞并未失去合成多藥耐藥基因蛋白的功能，因此從功能上來說，穩(wěn)定轉染的ILK的SHG44膠質(zhì)瘤細胞保持了原腫瘤細胞的功能特性。
　　

11、MTT法檢測各組細胞增殖結果顯示:在24小時，48小時及72小時三個時間點（ILK+TMZ組）的OD值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.01;以上結果說明過表達ILK能夠促進SHG44膠質(zhì)瘤細胞的增殖。
　　Hoechst法檢測結果:免疫熒光顯微鏡下，凋亡細胞呈現(xiàn)細胞核致密濃染或碎塊狀致密濃染，（穩(wěn)定轉染+TMZ）組凋亡細胞明顯少于（空載體+TMZ）組，說明過表達ILK能減少膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，即降低膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的敏感性

12、。
　　流式細胞術檢測:（穩(wěn)定轉染+TMZ）組早期凋亡細胞明顯少于（空載體+TMZ）組，說明過表達ILK可以減少膠質(zhì)瘤細胞在TMZ作用下的凋亡，即降低膠質(zhì)瘤細胞對TMZ的敏感性。
　　Westernblot檢測結果:(穩(wěn)定轉染+TMZ)組與(空載+TMZ)組比較，可以明顯提高腫瘤細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時可以明顯減少凋亡相關蛋白Bax的表達。結果顯示過表達ILK可以增加抗凋亡蛋白表達，同時減少凋亡相關蛋白的表達，從

13、而減少膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，降低了腫瘤細胞對TMZ的敏感性。
　　試劑盒法檢測Caspase3活性檢測:caspase-3的活性在(穩(wěn)定轉染+TMZ)組明顯低于(空載體+TMZ)組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，該結果說明過表達ILK可以降低凋亡關鍵酶caspase-3的活性，從而減少膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，降低了腫瘤細胞對TMZ的敏感性。
　　二、過表達ILK促進腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉移
　　Elisa法檢測結果和Weste

14、rnblot法檢測結果一致:穩(wěn)定轉染組的MMP-9、MMP-2表達均明顯增加，與對照組及空載組比較（P＜0.01）差異有統(tǒng)計學意義。
　　細胞劃痕實驗:6小時:空白對照組、空載組、穩(wěn)定轉染ILK組，細胞遷移率分別為:30％，33％，68％;12小時:空白對照組、空載組、穩(wěn)定轉染ILK組，細胞遷移率分別為:77％，76％，95％。穩(wěn)定轉染ILK腫瘤細胞移動速率增加(P＜0.01)，而對照組及空載組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.01)

15、。實驗表明過表達ILK可明顯增加SHG44腫瘤細胞的遷徙能力。
　　Transwell小室法:種植的各組細胞在培養(yǎng)24小時以后，計數(shù)膜的下表面細胞數(shù)結果:對照組和空載體組和穩(wěn)定轉染ILK組的細胞遷移數(shù)分別為:92、87、229。穩(wěn)定轉染ILK的細胞穿透膜的數(shù)目明顯高于其他兩組(P＜0.01)，而對照組與空載組的細胞穿透膜的數(shù)目無統(tǒng)計學差異(P＞0.01)，表明過表達ILK可明顯增強膠質(zhì)瘤細胞(SHG44)的侵襲能力。
　　三

16、、過表達ILK通過NF-κB信號通路促進腦膠質(zhì)瘤細胞的上皮間質(zhì)轉化
　　Westernblot檢測EMT標記物蛋白的表達:結果顯示穩(wěn)定轉染組中snail，slug，twist，vimentin的表達較對照組及空載組的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而E-cadherin的表達則在穩(wěn)定轉染組中明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　當分別用NF-kB特異性阻斷劑BAY11-7028及p65SiRNA的

17、方法阻斷該通路后，Westernblot方法檢測E-cadherin蛋白表達結果顯示:穩(wěn)定轉染組中E-cadherin蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　結論
　　1.穩(wěn)定轉染ILK的SHG-44腫瘤細胞系建立及篩選成功，并且該穩(wěn)定轉染細胞系ILK明顯過表達。
　　2.過表達ILK可以通過增加抗凋亡蛋白的表達，降低凋亡相關蛋白的表達、下調(diào)caspase-3的活性、抑制腫瘤細胞的凋亡、促進其增殖，降