粘附斑激酶通過Tuberin調(diào)節(jié)mTOR信號通路活性的分子機(jī)制.pdf

1、mTOR(mammaliantargetofrapamycin)屬于PIKK(phosphatidylinositolkinase-relatedkinase)超家族，是一個進(jìn)化上十分保守的Ser/Thr激酶。它可以整合上游來自生長因子、營養(yǎng)、能量及環(huán)境壓力的信號刺激，作用于其下游效應(yīng)分子，進(jìn)而在細(xì)胞增殖、生長等方面起著重要的調(diào)控作用。
　　 粘附斑激酶(Focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸

2、激酶，可以整合來自胞外的營養(yǎng)、壓力、細(xì)胞粘著等信號來調(diào)控細(xì)胞的生長、遷移等，是胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞。
　　 復(fù)合型結(jié)節(jié)性硬化癥(TuberousSclerosisComplex，TSC)是一種由常染色體突變導(dǎo)致的顯性遺傳疾病，由TSC1或TSC2兩個基因突變所引起。Tuberin是TSC2基因產(chǎn)物，與TSC1基因產(chǎn)物Hamartin在細(xì)胞內(nèi)以異源二聚體的形式發(fā)揮作用，是mTOR的上游負(fù)調(diào)控因子。
　　 FAK、Tuber

3、in都是參與mTOR信號通路調(diào)節(jié)的重要蛋白。但FAK是否可以通過與Tuberin的直接相互作用而參與mTOR信號通路調(diào)控尚不清楚。
　　 本研究以人293T細(xì)胞、小鼠STO細(xì)胞和絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞為材料，首先利用RNA干擾技術(shù)探究FAK表達(dá)受抑制后，其下游的效應(yīng)分子Akt、mTOR、S6K、S6的活性變化情況，明確FAK參與了mTOR信號通路的調(diào)控；次之以FAK作為誘餌蛋白利用免疫共沉淀和Westernblot技術(shù)檢測沉淀復(fù)合

4、物中Tuberin的存在，證明其有可能為FAK的作用靶。最后利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定FAK與Tuberin作用的具體片段。
　　 結(jié)果表明：1)FAK轉(zhuǎn)錄后沉默，mTOR信號通路的活性受到抑制。通路中phospho-mTOR(Ser2448)、phosphor-p70S6K(Thr389)、phospho-S6(Ser240/244)的活性明顯降低，但phospho-Akt(Ser473)的活性無顯著變化；2)FAK免疫共沉淀復(fù)合

5、物中有Tuberin存在，但不能檢出Akt；3)酵母雙雜交實驗表明全長FAK(aa.1-1052)和含有FAT結(jié)構(gòu)域的C-末端片段FAK3(665-1052aa)與Tuberin的中間片段TSC2F(aa.419-1080)具有直接的相互作用，可以激活全部四種報告基因AUR1-C、MEL1、HIS3與ADE2的表達(dá)。FAK的N-末端FERM結(jié)構(gòu)域FAK1(aa.1-400)和中間的激酶結(jié)構(gòu)域FAK2(aa.401-664)與TSC2F之

6、間沒有或僅有較弱的相互作用，沒有激活報告基因HIS3與ADE2。FAK的C-末端片段(665-1052aa)為FAK與Tuberin發(fā)生作用所必需。
　　 綜合RNAi、免疫共沉淀和酵母雙雜交的實驗結(jié)果并通過不同物種細(xì)胞系間結(jié)果的相互印證，可以確定FAK與Tuberin之間存在直接的相互作用關(guān)系，這種作用主要依賴于FAKC-末端片段的介導(dǎo)，F(xiàn)AK通過Tuberin直接參與mTOR信號通路的調(diào)控。這一研究結(jié)果使FAK信號通路和TS