基于Axin的活化復合體調節(jié)p53信號通路的分子機制.pdf

1、Daxx是一種重要的細胞死亡相關因子。近十年來的研究表明，Daxx通過其不同的功能結構域與多種參與細胞生理生化過程的蛋白相互作用而形成多蛋白復合體。這些多樣的蛋白復合體，涉及了細胞增殖、生長與分化，細胞凋亡，轉錄調控以及病毒復制等許多細胞復雜的生命活動。盡管獲得了大量實驗數(shù)據(jù)，但是，對Daxx在誘導細胞凋亡的具體作用機理方面，至今仍存在一些爭議。其中，有關系統(tǒng)揭示Daxx如何通過p53信號途徑誘導細胞死亡的課題亟待研究。故此，本論文采用

2、生物化學與分子生物學方法，系統(tǒng)闡明Daxx協(xié)同Axin/HIPK2/p53三聚復合體活化p53信號通路的分子機制及作用模型，從而強調出Daxx在促細胞凋亡方面的重要功能。本論文研究通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)了Daxx與Axin之間的相互作用。免疫共沉淀實驗進一步驗證了內源性的Daxx和Axin能在體內直接結合。并且，二者之間的這種相互作用，在細胞接受UV刺激條件下會明顯增強。一系列實驗結果均表明Daxx不能直接結合p53，但是Axin作為“

3、橋梁”介導了Daxx與p53的結合。之后的研究證實了Daxx/Axin／p53復合體的作用，即盡管Daxx能夠單獨活化與HIPK2結合的p53，但Axin明顯加強了這一作用，說明Daxx／Axin／HIPK2／p53復合體的形成能夠導致p53活性的最大化，其功能相關性進一步被RNA干擾實驗證明。而且，Daxx調節(jié)的細胞生長抑制依賴于功能性的Axin與p53，因為在克隆斑形成實驗中，Daxx不能誘導Axin缺失細胞和p53缺失細胞的細胞死

4、亡。敲除Daxx或Axin嚴重削弱了UV或p53誘導的凋亡，與Daxx/Axin/HIPK2/p53復合體能夠誘導p53活性最大化的實驗結論一致。有趣的是，Daxx和Axin似乎選擇性地活化p53的靶向基因，強烈活化PUMA基因，而非p21和Bax基因。本論文還發(fā)現(xiàn)Daxx和Axin能夠誘導細胞色素c的釋放，這與兩種蛋白均能誘導PUMA基因活化相吻合。所有這些結果顯示出，Daxx能夠調節(jié)Axin／HIPK2／p53復合體誘導細胞死亡，闡

5、明了Daxx調控腫瘤抑制子p53活化以及發(fā)揮促凋亡功能的新機理，也提示出Daxx在DNA嚴重損傷條件下誘導細胞死亡的分子機制。 Pirh2是一個RING結構域蛋白，先前已知它能夠與p53相互作用，并作為其E3連接酶負調節(jié)p53的穩(wěn)定性。在本論文研究中，我們通過酵母雙雜交篩選，已確定Pirh2作為一個新的Axin相互作用蛋白。目前證據(jù)顯示，Pirh2能夠通過破壞基于Axin的p53活化復合體的形成而抑制UV刺激響應下的p53活化

6、。通過結合Axin，Pirh2促使HIPK2從Axin復合體上解離，抑制了HIPK2蛋白激酶對p53的作用。不過，我們在研究中用Mdm2作為陽性對照，未發(fā)現(xiàn)Pirh2對p53顯示出任何E3連接酶活性。當與Pirh2共轉染時，p53的穩(wěn)定水平并沒有發(fā)生改變。并且，喪失E3活性的Pirh2突變體Pirh2 C145A未能削弱其對Axin或UV誘導下的p53第46位磷酸化的抑制功能。這些研究結果與先前的報道存在明顯差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)siRN