DNA損傷中NDRG2與P53的關(guān)系及NDRG2在P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的功能研究.pdf

1、DNA是機(jī)體生命活動(dòng)中最重要的遺傳物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性的保持對(duì)于細(xì)胞的存活和正常生理活動(dòng)具有重要意義。但是DNA 時(shí)刻面臨來(lái)自于生物體內(nèi)部或外部的侵襲，在細(xì)胞內(nèi)外各種損傷因素的作用下,受到不同程度的影響。生物體基因組完整性的維持依賴于體內(nèi)相互獨(dú)立但又密切聯(lián)系的兩套系統(tǒng)：DNA修復(fù)和凋亡。DNA損傷刺激產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，這一信號(hào)最終將被細(xì)胞周期或凋亡調(diào)控系統(tǒng)所接受。P53 分子是在DNA 損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，其下游

2、調(diào)控的靶基因，如P21 、14-3-3 、GADD45 和Bax 等分子，分別參與DNA 損傷后的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，在抑制細(xì)胞的癌變中發(fā)揮著重要作用。 人源NDRG2 ( 又名SYLD 或KIAA1248 )是我室在1999年利用基于PCR的消減雜交技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤與正常腦組織的基因表達(dá)差異研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)降低的新基因[GenBank 登錄號(hào)AF159092]，其mRNA 全長(zhǎng)為2024bp，編碼一

3、個(gè)含有357 個(gè)氨基酸殘基、分子量約41kDa的功能未知蛋白。該基因染色體定位在14q11.2，含有16 個(gè)外顯子，15 個(gè)內(nèi)含子。由于該基因在氨基酸序列上與已發(fā)現(xiàn)的N-myc 下游基因NDRG1(N-mycdown-stream regulated gene 1)具有較高的同源性，將其命名為NDRG2。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)NDRG2 基因進(jìn)行了較多的研究，對(duì)其功能已經(jīng)有了一些了解。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷藥物阿霉素- Adriam

4、ycin（簡(jiǎn)稱Adr），可以誘導(dǎo)A549 細(xì)胞中NDRG2表達(dá)水平的升高，提示NDRG2 可能參與了細(xì)胞的DNA 損傷。而P53 分子是參與DNA 損傷修復(fù)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法也發(fā)現(xiàn)，NDRG2第一內(nèi)含子區(qū)含有P53結(jié)合位點(diǎn)，并且已有研究報(bào)道，NDRG家族的另一成員—NDRG1，作為P53的靶基因參與了P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以上背景提示DNA損傷中NDRG2與P53可能存在一定的關(guān)系，NDRG2在P53介導(dǎo)的信號(hào)

5、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有可能發(fā)揮一定的功能。 為了驗(yàn)證上述假設(shè)，我們首先選用P53野生型細(xì)胞系A(chǔ)549和U87，應(yīng)用促進(jìn)DNA損傷的試劑Adr處理這些細(xì)胞不同時(shí)間后（0 h，3 h，6 h，12 h24 h），分別應(yīng)用Real-time PCR和Western blot的方法檢測(cè)到這些細(xì)胞中NDRG2的表達(dá)水平明顯升高，提示NDRG2 參與了這兩種細(xì)胞的DNA損傷過(guò)程。但是，應(yīng)用Adr 處理P53突變型細(xì)胞系(MDAMB-231 和SK-

6、BR-3)和P53缺失型細(xì)胞系(H1299)，卻發(fā)現(xiàn)在這些P53失活的細(xì)胞系中，DNA損傷試劑Adr并不能誘導(dǎo)NDRG2表達(dá)水平的升高，上述研究表明DNA損傷誘導(dǎo)的NDRG2表達(dá)水平升高依賴于P53。 為了進(jìn)一步明確P53與NDRG2的關(guān)系，我們通過(guò)在P53缺失的細(xì)胞系H1299中過(guò)表達(dá)外源性的P53，證實(shí)了NDRG2的表達(dá)水平隨著P53表達(dá)水平的升高而升高。通過(guò)報(bào)告基因的分析表明，無(wú)論外源性的野生型P53 或內(nèi)源性的野生型P

7、53都可以特異地通過(guò)NDRG2 第一內(nèi)含子區(qū)P53結(jié)合位點(diǎn)而明顯上調(diào)報(bào)告基因的活性，并且通過(guò)ChIP和EMSA的方法證實(shí)了P53可以特異地與該P(yáng)53結(jié)合位點(diǎn)相互作用，這些結(jié)果不僅為NDRG2是一個(gè)新的P53的靶基因提供了有力的證據(jù)，也為進(jìn)一步研究NDRG2的功能提供了新的線索。 最后，我們對(duì)NDRG2在P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮的功能及NDRG2對(duì)腫瘤細(xì)胞化療敏感性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，干涉NDRG2的表達(dá)可以明顯抑制P53介導(dǎo)

8、的細(xì)胞凋亡，提示NDRG2在由P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用；另外，過(guò)表達(dá)的NDRG2明顯抑制了細(xì)胞的增殖，當(dāng)應(yīng)用化療藥Adr和順鉑處理NDRG2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞時(shí)，可以明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。以上研究結(jié)果表明，NDRG2作為P53的一個(gè)新的靶基因，在P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)可以明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，并且證實(shí)了由過(guò)表達(dá)的NDRG2所增強(qiáng)的細(xì)胞的化療敏感性可以不依賴于P53。 綜

9、上所述，NDRG2是P53的一個(gè)新的靶基因，參與了細(xì)胞中的DNA損傷反應(yīng)，并且在P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)又是一個(gè)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的新基因。因此，我們的研究不僅完善了對(duì)P53 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識(shí)，而且進(jìn)一步明確了NDRG2的功能，為NDRG2在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了有力的線索和依據(jù)。 我實(shí)驗(yàn)中的最后一部分內(nèi)容與上述內(nèi)容不太相關(guān),是碩士課題的部分延續(xù)，目的主要是檢測(cè)HepG2細(xì)胞中NDRG2表達(dá)降低的