NDRG2在大鼠睪丸發(fā)育中的表達及其與生精細胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　NDRG2與NDRG1，NDRG3和NDRG4共同組成NDRG家族，該家族成員可能與細胞的增殖和分化相關(guān)，但其具體的生物學功能有待于進一步研究。在前期的研究中我們通過免疫組織化學染色觀察到NDRG2在成年人和小鼠睪丸內(nèi)均表達定位于睪丸間質(zhì)細胞，而在生精細胞內(nèi)未見明顯的陽性著色，推測其可能參與睪丸間質(zhì)細胞睪酮的分泌與調(diào)節(jié)，進而調(diào)控精子的發(fā)生，因此本實驗的目的在于探討NDRG2在睪丸發(fā)育與精子發(fā)生過程中的作用及其機制。

2、r>　　方法：
　　1．利用RT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交及免疫組織化學等方法對比研究出生后大鼠睪丸發(fā)育不同階段（1、5、15、21、35和75d）中NDRG2的表達與定位；并分離21、35和75d大鼠睪丸間質(zhì)細胞和生精細胞，利用RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交分析和驗證NDRG2在大鼠睪丸不同發(fā)育階段中表達的差異性。
　　2．建立成年大鼠單劑量MAA（650mg/kg）腹腔注射誘導精母細胞凋亡模型，采用TUNEL、RT-

3、PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡雜交、免疫組織化學、間接免疫熒光和激光顯微切割技術(shù)分析NDRG2在生精細胞凋亡過程中表達的變化，探討NDRG2與生精細胞凋亡之間的關(guān)系。
　　3．青春期大鼠睪丸內(nèi)生精細胞自發(fā)性凋亡達到頂峰，建立青春期（21d）大鼠隱睪模型，通過TUNEL染色驗證該模型、運用免疫組織化學和間接免疫熒光等方法分析NDRG2在隱睪和對照側(cè)睪丸表達的差異，并且分離術(shù)后不同時間點的間質(zhì)細胞和生精細胞，運用免疫印跡雜交檢測NDRG2和p

4、53的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1．RT-PCR和Westernblot結(jié)果均顯示NDRG2在出生后1d大鼠睪丸內(nèi)即有表達，隨后逐漸升高，至青春期達到頂峰（21和35d），在成年期其表達反而下降。免疫組織化學結(jié)果顯示NDRG2持續(xù)表達于睪丸間質(zhì)細胞，但在睪丸發(fā)育不同階段，其在生精小管內(nèi)的表達卻存在明顯的差異。在新生期（1和5d）主要表達于原始生殖細胞，而不表達于支持細胞；在15和21d大鼠睪丸，NDRG2在生精小管內(nèi)主要表

5、達于精母細胞，而精原細胞和支持細胞未見陽性著色；在35d大鼠睪丸，NDRG2在生精小管內(nèi)主要表達于精母細胞和圓形精子細胞；在成年（75d）大鼠，生精小管內(nèi)幾乎未見NDRG2陽性著色。分離純化21，35和75d大鼠睪丸生精細胞，采用RT-PCR和Westernblot進一步驗證了NDRG2在青春期大鼠生精細胞內(nèi)高表達，而在成年大鼠生精細胞內(nèi)幾乎不表達。分離純化21，35和75d大鼠睪丸間質(zhì)細胞，結(jié)果顯示NDRG2在這三個時間點間質(zhì)細胞內(nèi)均

6、有較強的表達，但相互間無明顯差異。
　　2．MAA腹腔注射3和6h與對照組相比未見顯著性差異，但MAA誘導12h后，成年大鼠睪丸內(nèi)出現(xiàn)大量初級精母細胞的凋亡，主要集中在生精周期的第X-XⅢ期，通過分離生精細胞和激光顯微切割技術(shù)均檢測到NDRG2在MAA誘導12h后在生精細胞的表達上調(diào)，免疫組織化學和間接免疫熒光結(jié)果均顯示NDRG2在自發(fā)性和MAA誘導凋亡的生精細胞中均高表達。
　　3．建立21d大鼠單側(cè)隱睪模型，術(shù)后7d和1

7、4d，隱睪側(cè)睪丸重量明顯減輕，凋亡生精細胞數(shù)明顯升高，免疫組織化學與間接免疫熒光結(jié)果顯示NDRG2在自發(fā)性和熱刺激誘導凋亡的生精細胞內(nèi)表達均明顯上調(diào)，但在一些正常的精母細胞和圓形精子內(nèi)仍存在一定量的表達，并且NDRG2在隱睪側(cè)間質(zhì)細胞的表達強度明顯降低。分離純化術(shù)后不同時間點隱睪側(cè)和對照側(cè)睪丸生精細胞，發(fā)現(xiàn)NDRG2和p53在術(shù)后7d隱睪側(cè)生精細胞的表達量明顯上調(diào)，而在隱睪后14d未見明顯差異，可能與生精細胞的凋亡與脫落有關(guān)；分離純化術(shù)

8、后不同時間點隱睪側(cè)和對照側(cè)睪丸間質(zhì)細胞，進一步證實了NDRG2在術(shù)后7和14d隱睪側(cè)間質(zhì)細胞的表達量減少。
　　結(jié)論：
　　1.NDRG2在大鼠睪丸發(fā)育不同階段持續(xù)表達于間質(zhì)細胞，可能參與睪丸早期發(fā)育和睪酮的分泌與調(diào)節(jié)。
　　2.NDRG2在大鼠睪丸發(fā)育過程中在生精細胞的表達存在較大差異，在青春期前在生精細胞有較高水平的表達，但在成年期表達量很低，提示NDRG2可能參與睪丸發(fā)育早期生精細胞增殖與分化的調(diào)節(jié)。